金雀异黄酮对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用△

张 静

视网膜缺血-再灌注(I/R)损伤是指视网膜组织缺血再次恢复血流灌注后，再灌注区视网膜发生进一步损伤，病因主要包括视网膜血管阻塞、急性青光眼、早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变[1-3]。由于视网膜高度依赖氧供应，I/R诱导的氧化应激被认为是视网膜损伤的直接原因[4-6]，I/R损伤会增加活性氧(ROS)水平，从而导致细胞凋亡和坏死，这是引起细胞死亡的重要原因[7]。炎症同样也是I/R损伤发生的另一重要原因[8-9]。

现有研究证实，黄酮类药物具有广泛的药理活性，主要包括抗炎、抗氧化、改善血脂代谢、改善心血管疾病预后等作用[10-12]。金雀异黄酮(GEN)是大豆异黄酮的主要活性成分之一。已有研究表明，GEN对降低血脂水平、抗脂质过氧化、改善心血管疾病、抗癌等方面都具有良好的效果[13-16]，此外,有研究表明,GEN对大鼠心肌I/R损伤具有保护作用，减少心肌细胞凋亡[17]，但其在视网膜I/R损伤后的保护作用相关研究较少。本研究通过建立大鼠视网膜I/R损伤模型，观察GEN对视网膜I/R损伤的改善作用，并初步探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料SPF 级健康无眼疾SD雄性大鼠，鼠龄为12周，体重200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。GEN(GEN纯度≥98%)购自嘉兴禾晟生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理选取30只健康Wistar大鼠，按照随机数字表法将其分为假手术组、I/R组和I/R+GEN组，每组各10只。I/R组和I/R+GEN组大鼠采用前房灌注生理盐水升高眼压法制备视网膜I/R损伤模型，I/R组大鼠术后每天予以腹腔注射生理盐水(1 mL·kg-1·d-1)，I/R+GEN组大鼠术后每天予以注射GEN (40 mL·kg-1·d-1)；假手术组大鼠行相应假手术后每天予以注射生理盐水(1 mL·kg-1·d-1)，连续处理7 d后，颈椎脱臼法处死各组大鼠，取眼部组织。

1.2.2 视网膜I/R损伤模型构建采用前房灌注生理盐水升高眼压法制备大鼠视网膜I/R损伤模型:腹腔注射异戊巴比妥钠麻醉大鼠，盐酸奥布卡因进行结膜表面麻醉 2 次，同时复方托吡卡胺滴眼液散瞳 2 次。输液器连接30 G针头，自大鼠颞侧角膜缘穿刺进入前房并固定，升高输液瓶(生理盐水250 mL)至形成109.7 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)的眼压[18]，若观察到球结膜苍白、眼底血管断流，表明视网膜缺血性损伤构建成功；1 h后降低输液瓶，使其高度与大鼠水平一致，将前房灌注针头拔出，以眼结膜颜色变红、视网膜血管血流恢复为大鼠视网膜I/R损伤模型构建成功。同时排除造模时角膜贯穿伤或造模后外伤性白内障的大鼠。假手术组大鼠仅穿刺，前房不灌注生理盐水。

1.2.3 HE染色检测各组大鼠视网膜各层厚度I/R 损伤后7 d处死各组大鼠，摘除眼球并在40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后，对视网膜组织进行石蜡包埋并切片，使用HE(Macklin，上海)染色，400倍光学显微镜(Olympus，日本东京)下观察并采集图像。既往研究表明，视网膜厚度可反映视网膜细胞数量的变化[19]，因此本研究测量了视网膜各层的厚度来量化细胞丢失的程度以判断大鼠视网膜的缺血性损伤。测量整个视网膜厚度(内界膜和色素上皮之间)、外核层(ONL)和外丛状层(OPL)、内丛状层(IPL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)的厚度。每组记录6眼的平均值作为代表值，重复3次。

1.2.4 免疫组织化学测定各组大鼠RGC相对存活率I/R损伤后7 d处死大鼠，摘除眼球并在40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后，从眼球中分离视网膜，PBS冲洗，进行视网膜中Ⅲ型微管蛋白免疫组织化学染色，荧光显微镜(Zaiss，德国)下观察染色情况，并计算阳性细胞的平均密度，即样本区内RGC存活细胞总数除以样本区面积,结果取与假手术组作为对照进行标准化后的相对存活率。

1.2.5 细胞凋亡的测定采用TUNEL(Roche,德国)法检测细胞凋亡情况。PBS洗涤3组大鼠视网膜细胞后，利用40 g·L-1多聚甲醛固定细胞30 min后再次进行洗涤，随后用含体积分数0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰孵2 min后再次洗涤2次。加入50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤2次，250 μL PBS悬浮细胞，涂片后在荧光显微镜下观察并进行定量分析。

1.2.6 各组大鼠视网膜中过氧化氢酶、丙二醛、总超氧化物歧化酶水平分析取各组大鼠视网膜组织，制备成匀浆后取上清液，按照说明书，利用过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物技术有限公司)进行CAT、MDA、SOD水平的测定。

1.2.7 Western blot检测视网膜I/R损伤后各组大鼠视网膜中NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达使用含有1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解缓冲液(碧云天，中国)提取各组大鼠视网膜组织总蛋白，然后使用增强的BCA蛋白分析试剂盒采用微孔板读取器(Flexstation 3，美国)测量NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离40 ng组织蛋白并转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad，美国)上。用50 g·L-1脱脂乳粉封闭2 h后，用一抗[抗NLRP3、ASC、 Caspase-1(1400)]孵育过夜后与二抗兔/小鼠抗-IgG(110 000)一起在室温下孵育2 h后洗涤，随后利用ECL化学发光系统(Biorad公司，美国)检测蛋白质条带并进行分析。

1.3 统计学分析应用SPSS 24.0统计学软件进行统计分析，计量指标采用均数±标准差表示，多组间总体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-q法。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜各功能层的厚度比较大鼠视网膜进行HE染色后结果显示， I/R组、I/R+GEN组和假手术组大鼠视网膜总厚度分别为(114.37±7.32)μm、(155.31±6.83)μm、(178.98±13.65)μm，3组总体比较差异有统计学意义(t=14.284，P<0.01)，I/R组大鼠视网膜总厚度低于假手术组，差异有统计学意义(t=12.681，P<0.01)，I/R+GEN组大鼠视网膜总厚度高于I/R组，差异有统计学意义(t=13.957，P<0.01)。I/R组、I/R+GEN组和假手术组大鼠视网膜IPL厚度分别为(18.95±5.06)μm、(20.69±8.13)μm和(11.73±3.15)μm，INL厚度分别为(17.62±4.69)μm、(25.74±6.78)μm和(11.97±3.56)μm，GCL厚度分别为(19.03±4.74)μm、(26.71±7.85)μm和(12.59±3.24)μm，OPL厚度分别为(6.89±2.41)μm、(7.93±3.46)μm和(9.47±5.24)μm，ONL厚度分别为(19.74±5.85)μm、(23.19±6.19)μm和(29.43±6.23)μm，3组大鼠IPL、INL和GCL厚度总体比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)，I/R组与假手术组IPL、INL和GCL厚度相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，I/R+GEN组与I/R组IPL、INL和GCL厚度相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图1)。

图1 HE染色观察各组大鼠视网膜各功能层的厚度 A：假手术组；B：I/R 组；C I/R+GEN组。

2.2 各组大鼠RGC存活率比较免疫荧光分析视网膜中Ⅲ型微管蛋白的含量来评估RGC的相对存活率，结果显示，I/R组、I/R+GEN组和假手术组大鼠视网膜中RGC相对存活率分别为(26.87±3.12)%、(73.46±7.80)%、(100.00±5.64)%，三组总体比较差异有统计学意义(t=16.825，P<0.01)，I/R组RGC相对存活率低于假手术组，差异有统计学意义(t=15.793，P<0.01)，I/R+GEN组RGC相对存活率高于I/R组，差异有统计学意义(t=15.106，P<0.01)(图2)。

图2 各组大鼠RGC相对存活率 A：假手术组免疫荧光图；B：I/R组免疫荧光图；C：I/R+GEN组免疫荧光图；D：免疫荧光定量分析。

2.3 各组大鼠视网膜细胞的凋亡和氧化应激反应利用TUNEL染色对各组大鼠视网膜细胞凋亡水平进行检测，结果发现，I/R组、I/R+GEN组和假手术组大鼠视网膜中CAT含量分别为(22.84±5.39)U·mg-1、(41.27±8.64)U·mg-1、(61.52±6.62)U·mg-1，MDA含量分别为(22.75±1.74) nmol·g-1、(10.68±3.46)nmol·g-1、(6.03±2.33)nmol·g-1，SOD含量分别为(0.37±0.05)U·g-1、(0.64±0.04)U·g-1、(0.95±0.08)U·g-1；三组大鼠视网膜中CAT、MDA、SOD水平总体比较，差异均有统计学意义(均为P<0.01)，I/R组与I/R+GEN组和假手术组大鼠视网膜中CAT、MDA、SOD水平比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.4 三组大鼠视网膜中NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达为了观察I/R损伤和GEN给药后各组大鼠视网膜炎症反应变化，本研究对NLRP3炎症小体激活进行研究，采用Western bolt方法分析炎症小体复合物三个重要组分的相对表达水平，结果显示，I/R组、I/R+GEN组和假手术组大鼠视网膜中NLRP3蛋白蛋白相对表达量分别为(413.25±26.34)%、(157.64±20.21)%、(100.00±12.36)%，ASC蛋白蛋白相对表达量分别为(371.29±33.66)%、(176.48±20.59)%、(100.00±15.27)%，Caspase-1蛋白相对表达量分别为(194.67±24.91)%、(443.17±42.39)%、(100.00±11.82)%；3组大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(均为P<0.01)，I/R组与I/R+GEN组和假手术组大鼠视网膜中NLRP3蛋白、ASC蛋白、Caspase-1蛋白水平相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3)。

3 讨论

已有研究表明，视网膜I/R损伤机制与一氧化氮调控、平衡钙离子稳态、炎症反应介入、钙超载、细胞凋亡、基因调控及氧自由基损伤等有密切关系[19]。随着研究的深入，有研究发现氧化应激可以引起视网膜I/R损伤中多条途径发生变化，如细胞凋亡与增殖、炎症反应、自由基产生、细胞程序性死亡等[20]。胡世兴等[18]研究发现，缺血60 min再灌注大鼠视网膜细胞12～48 h表现出凋亡现象，其中24 h最为严重。邓辉等[21]在探讨红参对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞损伤的影响时，发现红参可以抑制凋亡基因bcl-2和bax的表达，减少视网膜神经节细胞凋亡的发生[21]。本研究证实，I/R大鼠视网膜中ONL和GCL均可见凋亡细胞，该类凋亡细胞呈棕黄色，分布于各正常细胞之间，形态学上有核固缩、染色质凝固、核膜下成环形或半月形等。本研究结果与前人研究一致，表明视网膜I/R损伤可以引起细胞凋亡的发生。

GEN是黄酮类化合物常见的一种类型，广泛存在于豆科植物中，产生于苯丙氨酸代谢过程中[22]。研究表明，GEN具有降低血脂、抗脂质过氧化、改善心血管疾病、抗癌等作用。本研究发现，GEN可显著减少视网膜I/R损伤后视网膜中ONL和神经节细胞损伤，降低凋亡因子含量，阳性反应集中在神经节细胞和内界膜周围，呈现点状或块状着色，部分内界膜纵向阳性纤维突起可见增粗或增多，穿过GCL，进入IPL内侧，呈现阳性着色团；视网膜细胞外界膜处也可形成一条着色线，其中ONL可见弱阳性纤维，OPL可见阳性着色。GEN对大鼠视网膜I/R损伤的保护作用可能是通过以下机制进行：由于视网膜高度依赖氧供应，对受损的血流非常敏感，I/R损伤后诱导的氧化应激被认为是视网膜损伤的直接原因[4-6]，I/R损伤后会增加ROS水平，从而导致细胞凋亡和坏死，这是引起细胞死亡的重要调节因子[7]。

研究表明，I/R损伤后可诱导多种炎症介质，包括白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌[8-9]。另外有大量研究表明，NLRP3炎症小体参与了视网膜I/R损伤的病理过程[23-24]，NLRP3 炎症小体能够在视网膜I/R中被活化，过度活化的 NLRP3炎症小体可使无活性的 Pro-Caspase-1 转化为有活性的 Caspase-1，Caspase-1可间接介导炎症因子的释放，引起病理性的炎症反应增加[25]，缺血后细胞通过吞噬天然非特异性免疫系统的细胞，炎症反应加重，坏死细胞释放大量坏死因子介导炎症应激，导致I/R后视网膜的进一步损伤。本研究发现，与假手术组相比，I/R组和I/R+GEN组大鼠视网膜中CAT、MDA、SOD水平均明显降低，NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表达水平升高，表明这两组大鼠视网膜中过度的氧化应激及炎症反应的存在，而利用GEN治疗后得到明显改善，这与既往关于GEN具有抗氧化及抗炎的作用结论基本一致。该结果与前人研究一致，说明I/R损伤后视网膜细胞氧化及抗氧化能力失衡，最终给视网膜带来严重的破坏，而GEN对I/R后视网膜损伤具有良好的保护作用。

本研究虽然阐述了GEN对大鼠视网膜I/R损伤后对视网膜的保护作用是通过抗氧化和抗炎症机制实现的，但是该研究仍然有一定的局限性。首先，该研究选取大鼠数量、分组都较少，在后续研究中应当扩大样本量更深入研究；其次，本研究是在大鼠中进行，与高等哺乳动物代谢能力仍有一定差距，在将来的研究中应当选择更多动物模型进行研究；第三，本研究本没有找到GEN在大鼠体内的识别受体，在将来的研究中应当进一步研究其作用分子机制，所以，关于GEN 这一保护作用的具体机制尚需进一步研究加以揭示。