葡萄籽原花青素调控NLRP3/Caspase-1通路介导的焦亡途径对糖尿病视网膜病变大鼠的保护作用△

王彤彤 庄天微 谢 伟 帅 印 朴天华 帅天姣

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病人群严重的微血管并发症，会引起视网膜损害，造成视力下降，可降低患者的工作能力及生活质量，发展到晚期可导致失明，已成为亟待解决的公共卫生问题之一[1-2]。高血糖会触发活性氧(ROS)的过量产生，诱发视网膜组织强烈的氧化应激与炎症损伤，是DR的主要发病机制，抗氧化和抗炎是缓解DR进展的有效手段[3-4]。NLRP3是组织细胞调控炎症反应的重要信号分子，可促进下游Caspase-1蛋白表达，激活焦亡途径，诱导细胞炎性坏死即细胞焦亡，在DR的发生发展过程中具有关键调控作用，下调NLRP3/Caspase-1通路表达，可显著抑制高糖诱导的视网膜组织炎症，增强其抗氧化应激活性，减轻过氧化损伤，改善DR症状[5-7]，表明NLRP3/Caspase-1信号通路是治疗DR的重要作用靶点。葡萄籽原花青素是提取自葡萄籽中的一种类黄酮物质，是具有高效清除自由基功效的天然抗氧化剂。近年来研究表明，葡萄籽原花青素可下调NLRP3蛋白表达，抑制高糖引发的炎症与氧化应激反应，改善糖尿病大鼠肾缺血-再灌注损伤，并可通过抗炎及抗氧化活性抑制缺血-再灌注引发的视网膜组织细胞凋亡，保护视网膜功能[8-9]。但葡萄籽原花青素是否可通过调控NLRP3/Caspase-1通路介导的焦亡途径延缓DR病情发展，目前还未见相关报道，本研究通过建立DR大鼠模型，对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠购自牡丹江医学院[许可证号：SCXK(黑)2019-0003]，SPF级，雄性，体重210～230 g，饲养在牡丹江医学院动物中心独立动物房中[使用证号：SYXK(黑)2019-006]：室温 21～25 ℃，湿度45%～55%，每天定时通风换气，保持12 h/12 h明暗循环照明，食水不限，适应饲养1周后严格遵循动物使用的3R原则进行实验。

1.2 主要试剂与仪器葡萄籽原花青素(纯度95%)购自南京标科生物科技有限公司；VX-765购自美国Selleck生物科技有限公司；HE染色试剂盒、TUNEL试剂盒、ROS测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、白细胞介素(IL)-1β测定试剂盒、IL-18测定试剂盒、糖基化终末产物(AGEs)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源GAPDH一抗、兔源NLRP3一抗均购自美国Abcam公司；兔源Caspase-1一抗购自艾美捷科技有限公司。小动物眼底镜购自上海玉研科学仪器有限公司；One Touch II型血糖仪购自美国强生公司；Multiskan MK3酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；CX41光学显微镜购自日本Olympus公司；Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统购自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DR模型建立及分组给药参照文献[10]制备DR模型：大鼠在动物中心适应饲养1周后，腹腔注射65 mg·kg-1链脲佐菌素(以0.1 mol·L-1枸橼酸钠缓冲液溶解)一次，之后3 d内每天尾静脉采血测量血糖，血糖浓度不断升高，并选择72 h后血糖浓度≥16.7 mmol·L-1且出现“三多一少”症状的大鼠进行眼底镜检查，当大鼠眼底动静脉异常、毛细血管扩张并出现微血管瘤时，表示DR模型建立成功，随机分为模型组、葡萄籽原花青素组、VX-765组、葡萄籽原花青素+VX-765组(每组各12只)，另取12只大鼠，腹腔注射等剂量0.1 mol·L-1枸橼酸钠，设为对照组。

以9 g·L-1氯化钠溶液溶解购买的葡萄籽原花青素与VX-765，配制400 g·L-1葡萄籽原花青素溶液[8]、5000 g·L-1VX-765溶液[11]、葡萄籽原花青素(400 g·L-1)+VX-765(5000 g·L-1)的混合溶液，葡萄籽原花青素组大鼠腹腔注射10 mL·kg-1葡萄籽原花青素溶液及10 mL·kg-1的9 g·L-1氯化钠溶液；VX-765组大鼠腹腔注射10 mL·kg-1VX-765溶液及10 mL·kg-1的9 g·L-1氯化钠溶液；葡萄籽原花青素+VX-765组大鼠腹腔注射10 mL·kg-1葡萄籽原花青素溶液+VX-765混合溶液；模型组和对照组大鼠腹腔均注射20 mL·kg-1的9 g·L-1氯化钠溶液干预，每天干预1次，持续14 d。

1.3.2 标本采集末次药物干预结束后24 h，将大鼠置于乙醚气体中麻醉，使用5 mL注射器从颈动脉采血2 mL，于4 ℃、2500 r·min-1离心15 min，吸出上清保存在-80 ℃；接着颈椎脱臼法处死大鼠，每组随机选取6只大鼠摘下双侧眼球，于眼前节开窗注入40 g·L-1多聚甲醛固定液固定；然后去除玻璃体、晶状体和角膜，分离出视网膜组织，进行脱水、石蜡包埋后，沿眼球矢状面纵切，得到厚约4 μm的连续视网膜薄片；剩余6只大鼠摘下双侧眼球，分离出视网膜组织，保存在液氮中。

1.3.3 大鼠视网膜组织病理学变化及视网膜神经节细胞焦亡情况检测将1.3.2中的视网膜石蜡切片作常规脱蜡处理后，进行水化，选出3张切片行HE染色，以蒸馏水漂洗后脱水、透明、封片，在光镜下观察视网膜组织病理学形态并任选5个视野拍照；另选出3张切片，采用TUNEL试剂盒染色，在光镜下任选5个视野拍照观察，通过ImageJ软件计数视网膜神经节细胞(RGC)焦亡数及总数量，计算RGC焦亡率=RGC焦亡数/RGC总数量×100%。

1.3.4 大鼠视网膜组织SOD、CAT、ROS、MDA及血清中AGEs、IL-1β与IL-18水平测定取1.3.2中的视网膜组织，加入高强度RIPA裂解液匀浆，部分匀浆离心(4 ℃，3000 r·min-1离心20 min)后吸出上清，使用总蛋白定量测定试剂盒通过BCA法测定总蛋白浓度，然后每组取出0.15 mL匀浆，采用试剂盒测定其中SOD、CAT、ROS、MDA水平。

取1.3.2中的血清放在4 ℃冰箱中解冻，采用酶联免疫试剂盒测定各组血清中AGEs、IL-18、IL-1β水平。

1.3.5 大鼠视网膜组织NLRP3/Caspase-1通路蛋白表达水平检测1.3.4中剩余的视网膜组织蛋白样品液，根据测定结果将各组蛋白浓度调至相等，加入适量上样缓冲液，煮沸变性、快速离心，混匀后上样，经电泳(120 V，70 min)、湿转(40 mA，60 min)后，将转移至PVDF膜上的蛋白用50 g·L-1脱脂奶粉封闭(37.5 ℃，1.5 h)；根据相对分子质量截取目的蛋白GAPDH、NLRP3、Caspase-1条带，以相应的兔源一抗(GAPDH、NLRP3、Caspase-1抗体)孵育(4 ℃，9 h)，TBST溶液漂洗(3次，每次5 min)；羊抗兔二抗孵育(37.5 ℃，2 h)后TBST溶液再次漂洗(3次，每次5 min)；滴加化学发光液显色1 min后，以凝胶成像系统拍摄并用ImageJ软件分析各蛋白灰度值，采用GAPDH为内参蛋白，计算各蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.4 统计学分析本研究利用SPSS 21.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠的眼底镜检测情况与对照组相比，模型组大鼠眼底均可观察到明显的动静脉异常、毛细血管扩张、微血管瘤出现；与模型组相比，葡萄籽原花青素组、VX-765组大鼠眼底动静脉异常、毛细血管扩张等情况明显好转；葡萄籽原花青素+VX-765组大鼠眼底病变轻于葡萄籽原花青素组、VX-765组，与模型组差异较小(图1)。

图1 各组大鼠的眼底镜检查结果 A：对照组；B：模型组；C：葡萄籽原花青素组；D：VX-765组；E：葡萄籽原花青素+VX-765组。

2.2 各组大鼠视网膜组织病理学变化对照组大鼠视网膜组织各层细胞排列整齐紧密，结构层次分明，未见病理改变；模型组大鼠视网膜组织明显变薄，结构疏松，细胞结构层次紊乱、排列不规则，RGC变少、稀疏，呈现严重病理损伤变化；葡萄籽原花青素组及VX-765组大鼠视网膜组织形态结构得到恢复，病理损伤均有不同程度减轻；与葡萄籽原花青素组及VX-765组相比，葡萄籽原花青素+ VX-765组大鼠视网膜组织病理损伤进一步减轻，形态结构几乎恢复正常(图2)。

图2 HE染色检测各组大鼠视网膜组织病理学变化(×200) A：对照组；B：模型组；C：葡萄籽原花青素组；D：VX-765组；E：葡萄籽原花青素+VX-765组。

2.3 各组大鼠RGC焦亡情况与对照组[(0.47±0.13)%]相比，模型组大鼠RGC焦亡率[(34.16±4.28)%]明显升高(P<0.05)；与模型组相比，葡萄籽原花青素组[(15.39±3.54)%]及VX-765组[(15.43±3.67)%]大鼠RGC焦亡率均降低(均为P<0.05)；与葡萄籽原花青素组及VX-765组相比，葡萄籽原花青素+VX-765组大鼠RGC焦亡率[(0.65±0.20)%]均降低(均为P<0.05)(图3)。

2.4 各组大鼠视网膜组织抗氧化活性与对照组相比，模型组大鼠视网膜组织中SOD与CAT水平均明显降低(均为P<0.05)；与模型组相比，葡萄籽原花青素组及VX-765组大鼠视网膜组织中SOD与CAT水平均升高(均为P<0.05)；与葡萄籽原花青素组及VX-765组相比，葡萄籽原花青素+ VX-765组大鼠视网膜组织中SOD与CAT水平均升高(均为P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠视网膜组织中SOD与CAT水平

2.5 各组大鼠视网膜组织过氧化水平与对照组相比，模型组大鼠视网膜组织ROS与MDA水平均明显升高(均为P<0.05)；与模型组相比，葡萄籽原花青素组及VX-765组大鼠视网膜组织ROS与MDA水平均降低(均为P<0.05)；与葡萄籽原花青素组及VX-765组相比，葡萄籽原花青素+ VX-765组大鼠视网膜组织ROS与MDA水平均降低(均为P<0.05)(表1)。

2.6 各组大鼠血清中炎症因子水平与对照组相比，模型组大鼠血清中炎症因子AGEs、IL-1β与IL-18水平均明显升高(均为P<0.05)；与模型组相比，葡萄籽原花青素组及VX-765组大鼠血清中炎症因子AGEs、IL-1β与IL-18水平均降低(均为P<0.05)；与葡萄籽原花青素组及VX-765组相比，葡萄籽原花青素+ VX-765组大鼠血清炎症因子AGEs、IL-1β与IL-18水平均降低(均为P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠血清中炎症因子AGEs、IL-1β与IL-18水平

2.7 各组大鼠视网膜组织NLRP3/Caspase-1通路蛋白表达水平与对照组相比，模型组大鼠视网膜组织中NLRP3、Caspase-1蛋白相对表达水平均明显升高(均为P<0.05)；与模型组相比，葡萄籽原花青素组及VX-765组大鼠视网膜组织中NLRP3、Caspase-1蛋白相对表达水平均降低(均为P<0.05)；与葡萄籽原花青素组及VX-765组相比，葡萄籽原花青素+VX-765组大鼠视网膜组织NLRP3、Caspase-1蛋白相对表达水平均降低(均为P<0.05)(图4)。

图4 各组大鼠视网膜组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平 A：对照组；B：模型组；C：葡萄籽原花青素组；D：VX-765组；E：葡萄籽原花青素+VX-765组。与对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与葡萄籽原花青素组相比，cP<0.05；与VX-765组相比，dP<0.05。

3 讨论

近年来，随着营养物质摄入的富足，DR患病率逐年增加，已成为引起全世界视力损害和失明的主要原因之一，抗血管内皮生长因子(VEGF)药物是目前临床常用的DR治疗用药，但该类药物一般针对DR病情进展到新生血管形成时的患者，且需每月注射，会使患者产生较大的精神压力，并带来沉重的经济负担。因此，寻找新型药物在DR的早期预防及治疗中具有重要意义[10,12-13]。本研究以腹腔注射链脲佐菌素的方法诱导建立DR模型，结果显示，建模大鼠血糖浓度明显升高，视网膜组织中ROS与MDA水平，血清中AGEs、IL-1β与IL-18水平显著升高，SOD与CAT水平显著降低，视网膜组织明显变薄，结构疏松，细胞结构层次紊乱、排列不规则，RGC变少、稀疏，呈现严重病理损伤变化，RGC焦亡严重，表明腹腔注射链脲佐菌素可升高大鼠血糖，刺激炎症因子和ROS大量生成，引发强烈的炎症反应，减弱抗氧化活性，导致RGC变性焦亡，造成视网膜组织严重的病理损伤，促使DR发生发展，提示大鼠DR模型诱导成功。

许多研究表明，高糖引发的氧化应激和炎症反应是DR发生的重要因素，抗炎与抗氧化药物的应用在DR的预防、病情缓解及早期治疗中发挥着重要作用[14-15]。葡萄籽原花青素作为一种天然黄酮类抗氧化剂，可明显减轻糖尿病大鼠炎症反应及氧化应激损伤，保护其肾组织免受缺血-再灌注损伤，还可减弱过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤，通过抑制缺血-再灌注导致的炎症及氧化应激损伤而保护视网膜组织，因而推测葡萄籽原花青素可能对DR具有治疗作用[8-9,16]。本研究结果显示，葡萄籽原花青素可减轻DR大鼠视网膜组织病理损伤，降低其RGC焦亡率，视网膜组织中ROS与MDA水平，血清中AGEs、IL-1β与IL-18水平，升高视网膜组织中SOD与CAT水平，表明葡萄籽原花青素可清除高糖诱导产生的ROS，降低炎症因子水平，增强大鼠抗氧化功能，减轻视网膜组织炎症及氧化应激损伤，抑制RGC焦亡，缓解DR进展。

NLRP3炎症小体信号在DR的发病及病情发展过程中起到重要的调控作用，高糖可诱导并促进NLRP3炎症小体形成，进而激活下游Caspase-1焦亡信号通路，导致视网膜组织细胞变性死亡[5-7,17]，抑制NLRP3/Caspase-1信号转导，可增强糖尿病大鼠抗氧化活性，减轻炎症，降低氧化应激水平，缓解视网膜组织病变，因而干扰NLRP3/Caspase-1信号转导是防治DR的有效手段[18]。本研究以葡萄籽原花青素处理DR大鼠，可降低视网膜组织中NLRP3与Caspase-1蛋白表达，且以葡萄籽原花青素和NLRP3抑制剂VX-765联合处理DR大鼠，可增强葡萄籽原花青素对DR大鼠的治疗作用，两者具有协同作用，表明葡萄籽原花青素抑制DR大鼠RGC焦亡，保护其视网膜组织，可能是通过下调NLRP3/Caspase-1通路实现的。

总之，葡萄籽原花青素可显著抑制高糖诱导的ROS及炎症因子产生，减轻炎症反应和过氧化反应，缓解视网膜组织病理学损伤，抑制RGC焦亡，延缓DR病情进展，下调NLRP3/Caspase-1信号通路可能是其发挥上述药理功效的作用机制。本研究为DR的临床治疗带来了新的希望，但关于其药理机制的研究还不够深入，后续还会通过激活NLRP3/Caspase-1信号通路进行对照验证。