脑震宁方对模型大鼠脑组织神经元的保护作用*

赵乐，刘海霞，刘涛，窦殿奎，张晨曦，王超群，3，王永辉，王旭文

(1.山西中医药大学基础医学院，晋中 030619；2.山西振东生物制药有限公司，晋中 030600；3.湖北中医药大学基础医学院，武汉 430065)

脑震荡属于原发性颅脑损伤中常见的轻度脑损伤，多见于交通意外、运动、军队训练、爆破等。患者在头部受到剧烈撞击后出现的意识障碍、记忆力缺失、及恶心、呕吐等[1]在休息后可恢复，但部分患者会留有头痛、眩晕、失眠[2-4]等后遗症。脑震宁方于2017年入选首批“山西名药”名录，为行气活血、养心安神的有效方剂。临床研究证实，其对脑外伤和颅内血肿等有确切疗效，且对脑震荡后出现的头痛、头晕、健忘、失眠等均有缓解作用[5]。本实验探讨脑震宁方对脑震荡神经元结构和功能相关介质的作用，为脑震荡的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级SD大鼠，体质量(170±10) g，64只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006，合格证号：11400700352037。实验通过山西中医药大学动物伦理委员会批准，大鼠饲养于山西中医药大学实验中心动物房，饲养环境：温度(22±2) ℃，湿度(50±10)%，24 h昼夜节律光照。适应性喂养1周后开始实验。

1.1.2药材与试剂 脑震宁颗粒(山西振东安特生物制药有限公司，批号：201803)，吡拉西坦(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：6180306)，甲苯胺蓝染液(北京雷根生物技术有限公司，批号：1031A18)，Weil 髓鞘染色液(Bioswamp公司，批号：CY1710)，诱导型一氧化氮合成酶(institute nacional de obras sanitarias，iNOS)、基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、白细胞介素6( IL-6)一抗(Bioswamp公司，批号：PAB43765，PAB40457，PAB32097，PAB40563)，二抗试剂盒(武汉博士德公司，批号：12L2B)，二氨基联苯胺显色剂(Bioswamp，批号：PAB180021)，Trizol(Ambion公司，批号：15596026)，YBR Green PCR 试剂盒(KAPA Biosystems公司，批号：KM4101)，逆转录试剂盒(Takara公司，批号：639505)。

1.1.3仪器 组织包埋机及冷冻机(泰维科技有限公司，TB-718D，TB-718L)，石蜡切片机(徕卡显微系统有限公司，RM2235)，恒温烘箱(上海恒一科学仪器有限公司，DHG-9023A)，正置显微镜(徕卡显微系统有限公司，DM1000)，荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1模型制备 按照随机数字表法随机选取54只大鼠，采用金属单摆闭合式[6-7]击打大鼠脑颞部，角度70 °，制备单纯性脑震荡大鼠模型，同时满足下列条件者纳入实验模型：①大鼠受撞击后即刻出现一过性呼吸频率减慢或暂停，但不超过20 s逐渐恢复呼吸节律；②翻正反射消失，但不超过3 min，恢复后无运动障碍。

1.2.2分组及给药 将造模成功的50只大鼠采用随机数字表法分为5组，依次为模型对照组，吡拉西坦组和脑震宁小、中、大剂量组，每组10只。造模24 h后，各组大鼠分别灌服相应药物，剂量(根据药理实验大鼠和人体给药体表面积公式换算)分别为：脑震宁大、中、小剂量组10.0，5.0，2.5 g·kg-1，吡拉西坦组0.324 g·kg-1，每天1次。另取正常大鼠10只作为正常对照组。正常对照组和模型对照组大鼠分别灌胃等体积纯化水，均连续21 d。

1.2.3指标检测

(1)一般状态观察。每日观察大鼠自主活动行为，摄食量、饮水量、皮肤毛色变化等。

(2)取材。末次给药24 h后，麻醉大鼠处死后，冰盘中开颅取脑组织，4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水、透明、石蜡包埋，切片后待染色。

(3)Weil氏染色观察髓鞘分布。对空白切片组织行常规Weil氏染色，显微镜下观察大脑胼胝体、脑干、小脑白质等部位神经髓鞘排列。

(4)甲苯胺蓝染色检测尼氏体表达。常规甲苯胺蓝染色，显微镜下观察脑组织内尼氏体表达，并利用Image-6.0对尼氏体平均吸光度进行分析。

(5)免疫组化检测脑组织iNOS、IL-6、GFAP和MMP-9蛋白表达。对切片组织进行常规免疫组化染色后(一抗浓度均为1：300)，显微镜下观察并分析组织IL-6、iNOS、GFAP和MMP-9的阳性表达。

(6)RT-PCR检测脑组织细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、IL-6和MMP-9 mRNA表达。对脑组织海马取材后，依次进行总RNA提取、反转录、基因扩增，以2-△△CT法计算各指标的mRNA表达。PCR扩增条件为：95 ℃，10 min；60 ℃，60 s；72 ℃，5 min；40个循环。β-actin为内参，IL-6、ERK和MMP-9引物序列见表1。

表1 ERK、IL-6和MMP-9 引物序列Tab.1 Primer sequences of ERK，IL-6 and MMP-9

2 结果

2.1脑震宁方对脑震荡模型一般状况的影响 实验期间，模型对照组大鼠精神躁狂，警惕性增强，被毛萎黄脏乱，摄食减少；各给药组大鼠随给药时间延长狂躁表现逐渐改善，摄食逐渐增加。

正常对照组大鼠各部位神经髓鞘排列整齐，无断裂、弯曲肿胀等现象；模型对照组神经髓鞘排列紊乱，甚至弯曲肿胀、变形或断裂；各治疗组大鼠髓鞘弯曲肿胀减轻，其中吡拉西坦组和脑震宁中、大剂量组大鼠神经髓鞘破坏恢复程度较好，见图1。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡拉西坦组；D.脑震宁小剂量组；E.脑震宁中剂量组；F.脑震宁大剂量组。图1 6组大鼠脑组织神经髓鞘排列(Weil氏染色，×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.1 Arrangement of nerve myelin sheath in brain tissues of six groups of rats(Weil stain，×200)

2.2脑震宁方对脑震荡模型脑组织内尼氏体表达(吸光度)的影响 正常对照组脑组织神经元细胞质内尼氏体深蓝色；模型对照组较正常对照组神经元尼氏体显著减少(P<0.05)，且染色淡浅；各治疗组大鼠神经元尼氏体染色加深，与模型对照组比较，吡拉西坦组和脑震宁小、中剂量组尼氏体显著增加(P<0.05)，见表2和图2。

表2 6组大鼠脑组织尼氏体的表达(吸光度)Tab.2 Expression of Nissl body in brain tissues of six groups of rats(absorbance)

2.3脑震宁方对脑震荡模型脑组织IL-6、iNOS、GFAP和MMP-9阳性表达的影响 见图3，GFAP、iNOS、IL-6和MMP-9阳性表达呈现淡黄或棕黄色，iNOS和IL-6主要分布在细胞质内，MMP-9主要分布在细胞膜上，GFAP在细胞质和细胞膜均有分布。与正常对照组比较，模型对照组脑组织GFAP、iNOS、IL-6和MMP-9表达显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，各治疗组GFAP、iNOS表达显著降低(P<0.05)，同时，除脑震宁中剂量组外，各用药组IL-6、MMP-9表达显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 6组大鼠脑组织GFAP、IL-6、iNOS和MMP-9的表达(吸光度)Tab.3 Expressions of GFAP，IL-6，iNOS and MMP-9 in brain tissues of six groups of rats(absorbance)

2.4脑震宁方对脑震荡模型海马ERK、IL-6和MMP-9 mRNA表达的影响 与正常对照组比较，模型对照组ERK、IL-6和MMP-9 mRNA表达均显著升高(均P<0.05)。与模型对照组比较，各治疗组IL-6表达均显著降低(均P<0.05)，同时，吡拉西坦组和脑震宁中剂量组ERK、MMP-9 mRNA表达均显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 6组大鼠脑组织ERK、IL-6和MMP-9 mRNA的相对表达Tab.4 Relative expression of ERK，IL-6 and MMP-9 mRNA in brain tissues of six groups of rats

3 讨论

脑震荡临床常表现为一过性眩晕、昏迷、记忆缺失，未见脑部影像学异常，导致其在临床诊治中未予以足够重视。现代病理学研究认为，其发生伴随脑组织神经细胞损伤。神经元及其轴突是神经信号形成和信息传递的重要环节，脑震荡发生后如未及时救治，出现脑组织缺血缺氧以及炎症反应等，造成脑组织充血以及细胞变性和坏死等为主的神经元损伤[8]，发生情感和认知障碍等[9]。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡拉西坦组；D.脑震宁小剂量组；E.脑震宁中剂量组；F.脑震宁大剂量组。图2 6组大鼠脑组织尼氏体的表达(甲苯胺蓝染色，×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.2 Expression of Nissl body in brain tissues of six groups of rats(toluidine blue staining，×200)

脑震宁方中地黄和当归滋阴养血，丹参、丹皮和川芎行气活血化瘀，酸枣仁、柏子仁安神养血宁心，佐以陈皮、茯苓和竹茹和胃止呕，全方共奏行气活血、养血安神、降逆止呕之功。研究认为，活血化瘀法有抗炎、免疫调节和保护神经血管单元的功能[10]。

现代研究认为，神经细胞中少突胶质细胞是神经元髓鞘形成细胞，星形胶质细胞对神经元结构起支撑和营养作用。此外，小胶质细胞是中枢神经系统唯一的免疫细胞，可调节脑组织内免疫炎症因子和营养物质表达，调节脑内环境及神经细胞功能。GFAP是胶质细胞的骨架组成蛋白[11]，GFAP过度分泌会导致胶质瘢痕形成，影响神经细胞的再生。MMP-9具有降解细胞外基质的作用[12]。实验表明，脑震荡后大鼠脑组织GFAP和MMP-9表达升高，且病理研究显示，脑组织髓鞘存在明显肿胀、排列紊乱，以及尼氏体数量减少，说明脑震荡发生时存在神经细胞结构的异常；脑震宁方可下调模型大鼠神经元GFAP和MMP-9表达，改善髓鞘肿胀以及尼氏体数量减少的神经损伤性病理变化，说明脑震宁方对脑震荡后脑组织神经元损伤修复和促进再生具有良性调节作用。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡拉西坦组；D.脑震宁小剂量组；E.脑震宁中剂量组；F.脑震宁大剂量组。图3 6组大鼠脑组织GFAP、IL-6、iNOS、MMP-9细胞阳性的表达(×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.3 Expression of GFAP，IL-6，iNOS and MMP-9 in brain tissues of six groups of rats( ×200)

星形胶质细胞和小胶质细胞不仅参与神经元结构组成，二者还相互耦联，参与脑组织内的免疫调节和炎症反应。在脑组织发生缺血缺氧、感染或创伤时，神经胶质细胞激活，其分泌神经营养物质和免疫调节因子，以支持髓鞘蛋白合成，维护神经元微环境稳态的作用被抑制；小胶质细胞则极化为具有刺激炎症反应的M1型细胞，造成神经元的功能异常和结构损伤[13]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activeated protein kinase，MAPK)与炎症反应等关系密切，ERK1/2通路是MAPK信号通路的主要组成通路之一。研究证实，炎症反应可激活MAPK通路，并参与神经性疾病的发生和发展[14]；同时，激活p38MAPK可直接转录调控星形胶质细胞中的iNOS和肿瘤坏死因子(TNF)-α等，导致慢性神经炎症。整合药理学研究认为，MAPK通路为脑震宁干预脑震荡的主要信号通路[15]，本课题组研究也发现，脑震荡模型ERK表达异常升高，同时，脑组织内IL-6、iNOS表达也显著升高。IL-6是炎症反应的关键因子，其通过β链向脑组织各类细胞传递信息，诱导神经元分化，参与脑组织炎症反应[16]；iNOS在颅脑损伤过程中的高表达，使其与氧自由基结合生成强氧化剂，氧自由基清除物质谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶等降低[17]，造成氧化损伤性神经毒性，在加重神经炎症反应的同时，造成神经细胞肿胀和死亡[18]。

研究发现，ERK激活是MMP-9活化和过度表达的必要条件，且已证实抑制ERK对下调MMP-9表达有很好的作用，MAPK抑制剂P38可明显减少MMP-9表达[19]。结合MAPK对神经炎症反应的促进作用，提示神经MAPK通路可能通过神经细胞内炎症反应参与神经细胞结构的改变。脑震宁方干预后，脑组织ERK及IL-6、iNOS均受到抑制，结合活血化瘀、养血之功效对抗炎及修复脑神经损伤的作用，提示脑震宁方对脑组织神经元的修复作用与其调节ERK信号通路，减轻炎症反应有关。

综上所述，脑震荡发生可能通过ERK通路参与神经炎症反应，导致神经细胞的过度增生、肿胀等。脑震宁方可抑制IL-6、iNOS及MMP-9、GFAP的表达，从而起到修复神经元结构和功能的作用。脑震宁中剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义，大剂量组较小剂量组的变化幅度更小，且差异无统计学意义，提示脑震宁剂量以中剂量组为佳；但是，各剂量组中，IL-6和MMP-9蛋白和基因相对表达量未完全一致，反映脑震宁方对脑震荡的作用存在基因表达和蛋白表达的不同步性，今后可进一步进行免疫印迹分析，对蛋白和蛋白磷酸化进行定量，从功能激活角度对脑震宁方的有效剂量进行深入探索。