葱白提取物对心肌缺血-再灌注损伤大鼠的保护作用及其机制*

田立群，雷杰，祝炜，冯莹，张妍，董莹，柯于鹤

(1.武汉市第一医院心血管内科，武汉 430022；2.湖北中医药大学第一临床学院，武汉 430060)

心血管疾病已经成为全球首位致死疾病，每年死于心血管疾病的人数多于其他任何疾病[1]。尽早进行再灌注治疗目前已成为改善心肌缺血损伤的有效方法，且能有效降低心肌梗死死亡率，但需要注意的是血供改善后出现心肌损伤加重的情况，即心肌缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤[2]。心肌I/R损伤的发生与多种病理机制[3]包括氧化应激、细胞内钙离子(Ca2+)超载、炎症反应加剧、线粒体功能障碍和细胞自噬等密切相关。近年来细胞凋亡对心肌功能的影响及I/R损伤的发生逐渐成为研究热点。心肌细胞受损导致凋亡诱导因子、细胞色素C等从细胞内释放，加速细胞凋亡进程[4-5]，并对心肌造成不可逆性损伤。葱白提取物(fistular onion bulb，FOB)是从华夏小葱白茎中提取的有效物质，主要活性成分为硫化物、黄酮类化合物、甾体皂苷、不饱和脂肪酸等。本课题组前期研究工作发现FOB能明显缩小大鼠I/R损伤的心肌梗死面积，改善炎症反应和缺氧状态，恢复正常心功能[6-7]。为进一步研究FOB对I/R损伤的保护机制，笔者构建I/R损伤大鼠模型，从细胞凋亡角度探讨FOB对I/R损伤大鼠的保护作用及其可能的机制，以期为临床防治心肌I/R损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级成年SD大鼠60只，体质量200～220 g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物使用许可证号：SYXK(鄂)2017-0067。大鼠饲养于恒温(23～25 ℃)、恒湿(相对湿度50%～60%)动物房。本实验过程对动物的处置均符合动物伦理学标准。

1.1.2药物与试剂 FOB(武汉市第一医院提供，批号：20170326)，硝酸甘油片(山东信谊制药有限公司，批准文号：国药准字H37021445)。 大鼠B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、β微管蛋白(β-tubulin) 抗体(Cell Signaling公司，批号分别为：#3498，#2774，#2146)，细胞色素C(Cyt-C)抗体、凋亡酶激活因子1(Apaf-1)抗体(Abcam，批号分别为：ab13575，ab2001)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 抗体(CST公司，批号为：#7074)，肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A032-1-1，A020-2-2，H197)，逆转录试剂盒、SYBR Green RT-qPCR 试剂盒(武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号：RK20400，RK20404)，引物由武汉谷歌生物有限公司合成，其余试剂均为市售分析纯。

1.1.3仪器 超净工作台(Heraguard型，美国Thermo公司)，超低温冰箱[MDF-U32V(N)型，日本SANYO公司]，组织包埋机(EG1150型，德国Leica公司)，组织切片机(CV5030型，德国Leica公司)，倒置显微镜(DMi8型，德国Leica公司)，高速冷冻离心机(5910R型，德国Eppendorf公司)，凝胶成像系统(GelDoc XR型，美国伯乐公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组与给药 实验前大鼠适应性喂养1周，按照随机数字表法分为假手术组、I/R组、FOB小剂量(300 mg·kg-1)+ I/R组、FOB中剂量(600 mg·kg-1)+ I/R组、FOB大剂量(1200 mg·kg-1)+I/R组、硝酸甘油(600 mg·kg-1)+I/R组，每组10只。给药剂量为2 mL·kg-1，每天灌胃1次，连续14 d，假手术组和I/R组给予等容积纯化水。

1.2.2大鼠I/R损伤模型建立 参考宋忠阳等[8]介绍的方法建立大鼠I/R损伤模型。10%戊巴比妥钠3 mL·kg-1麻醉大鼠并固定，气管切开后接入人工呼吸机进行机械通气，随后打开胸腔，充分暴露心脏，找到冠状动脉，于左心耳下缘与肺动脉圆锥间距主动脉根部约2 mm处进针结扎左冠状动脉前降支，以心电图QRS波加大和ST抬高作为缺血成功的标准。结扎30 min后松开结扎线实施再灌注24 h。假手术组只穿线不结扎，其余各组操作同I/R组。造模过程中死亡大鼠予以补足，确保每组有10只大鼠造模成功。

1.2.3心功能检测 再灌注24 h后，行左侧颈总动脉插管至左心室，通过多导生理记录仪进行数据采集和分析左心室功能变化。检测指标：心率(HR)、左心室短轴缩短率(fractional shortening，FS)、射血分数(ejection fraction，EF)以及早期舒张波(Em)/晚期舒张波(Am)。

1.2.4血清样本采集 检测左心室功能后，打开腹腔行腹主动脉取血，4 ℃静置0.5 h，5000 r·min-1(r=13.5 cm)离心10 min，分离血清置于超低温冰箱保存备用。

1.2.5心肌酶谱检测 将冻存备用的血清常温解冻，再次离心15 000 r·min-1(r=4.0 cm)10 min后取上清液，ELISA法检测大鼠血清CK、LDH和CK-MB浓度，具体操作按说明书严格进行。

1.2.6Western blotting检测Bax和Bcl-2蛋白表达 取心肌组织加入适量蛋白裂解液反应10 min，15 000 r·min-1(r=4.0 cm)离心15 min取上清液，取25 μL按照二喹啉甲酸法行浓度测定。随后进行SDS-PAGE凝胶垂直电泳转印系统100 V电泳60 min，100 V转膜140 min，5%脱脂奶粉封闭60 min，TBST缓冲液洗3次，每次10 min。加入Bax、Bcl-2一抗(稀释浓度1：1000)，4 ℃孵育过夜后洗涤3次，每次10 min，随后加入辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(稀释浓度1：1000)，并室温孵育60 min，TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min。电化学发光显影，Tanon-5200全自动发光成像分析系统摄片，采用Image J对蛋白条带进行灰度值测定。

1.2.7实时-聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测Bax、Bcl-2 mRNA表达 取冻存备用心肌组织100 mg，Trizol法提取各组总RNA，测定RNA浓度及纯度。将总RNA 1 μg按试剂盒说明书操作步骤进行逆转录成cDNA；PCR反应体系为20 μL：10×扩增缓冲液10 μL、上下游引物(表1)各0.4 μL和cDNA模板0.5 μL混合加超纯水至20 μL；PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共25个循环；最后72 ℃延伸10 min。取RT-PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭0.5 μg·mL-1)，GDS凝胶成像并分析Bax、Bcl-2 mRNA吸光度与β-actin mRNA吸光度的比值计算相对表达量。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.8免疫荧光检测Cyt-C和Apaf-1的表达 心肌组织经石蜡切片脱蜡水化，3%过氧化氢(H2O2)孵育，以0.01 mol·L-1枸橼酸盐煮沸，加入正常山羊血清室温封闭。滴加Cyt-C、Apaf-1抗体(1：200)，4 ℃湿盒孵育过夜(阴性对照加磷酸盐缓冲液)，次日滴加荧光二抗标记(1：100)37 ℃湿盒孵育1 h，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚复染核。封片后1 h内荧光显微镜观察和拍照，图像转件Image-Pro Puls 6.0分析各组荧光积分吸光度值。

2 结果

2.1各组大鼠心功能变化的比较 见表2，与假手术组比较，I/R组EF、FS和Em/Am值明显下降(P<0.05)，显示心功能明显受损；与I/R组比较，FOB小、中、大剂量+I/R组以及硝酸甘油+I/R组EF、FS及Em/Am比值均不同程度升高(P<0.05)，FOB+I/R各组心功能明显改善。

表2 6组大鼠心功能变化Tab.2 Cardiac function changes in six groups of rats

2.2各组大鼠血清CK、LDH和CK-MB水平比较 与假手术组比较，I/R组大鼠血清CK、LDH和CK-MB水平均显著升高(P<0.05)；与I/R组比较，FOB小、中、大剂量+I/R组血清CK、LDH和CK-MB水平均有不同程度降低(P<0.05)，且呈现一定的量效关系(表3)。

表3 6组大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平比较Tab.3 Comparison of serum levels of CK，LDH and CK-MB among six groups of rats

2.3FOB对各组Bax和Bcl-2蛋白表达的影响 如图1和表4所示，与假手术组比较，I/R组Bax蛋白表达显著升高，而Bcl-2 蛋白表达则显著降低，Bax/Bcl-2值明显升高(P<0.05)；与I/R组比较，FOB小、中、大剂量+I/R组Bax蛋白表达量下降，而Bcl-2 蛋白表达则显著增加，同时Bax/Bcl-2值则明显下降(P<0.05)，且呈现一定的量效关系。

表4 6组大鼠Bax和Bcl-2 蛋白表达水平比较Tab.4 Comparison of the protein expression of Bax and Bcl-2 among six groups of rats

2.4FOB对各组Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响 如图2所示，与假手术组比较，I/R组Bax mRNA相对表达水平升高，Bcl-2 mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)；与I/R组比较，经FOB预处理后，小、中、大剂量+I/R组Bax mRNA相对表达水平呈现不同程度下降，而Bcl-2 mRNA相对表达水平则明显升高(P<0.05)。

A.假手术组；B.I/R组；C.FOB小剂量+ I/R组；D.FOB中剂量+I/R组；E.FOB大剂量+I/R组；F.硝酸甘油+I/R组。图1 6组大鼠Bax和Bcl-2蛋白的表达A.sham group；B.I/R group；C.FOB low dose + I/R group；D.FOB medium dose + I/R group；E.FOB high dose + I/R group；F.nitroglycerin + I/R group.Fig.1 Protein expression of Bax and Bcl-2 in six groups of rats

2.5FOB对各组大鼠Cyt-C、Apaf-1蛋白表达的影响 如图3所示，与假手术组比较，I/R组Cyt-C和Apaf-1蛋白表达均明显增加(P<0.05)；与I/R组比较，FOB小、中、大剂量+I/R组以及硝酸甘油+I/R组的Cyt-C和Apaf-1蛋白阳性表达均显著降低(均P<0.05)，其中FOB中、大剂量+I/R组降低更加明显。

A.假手术组；B.I/R组；C.FOB小剂量+ I/R组；D.FOB中剂量+I/R组；E.FOB大剂量+I/R组；F.硝酸甘油+I/R组。①与假手术组比较，t=3.85，8.63，P<0.05；②与I/R组比较，t=2.36～7.52，P<0.05。图2 6组大鼠Bax和Bcl-2 mRNA 的表达水平及半定量分析A.sham group；B.I/R group；C.FOB low dose + I/R group；D.FOB medium dose + I/R group；E.FOB high dose + I/R group；F.nitroglycerin + I/R group.①Compared with sham group，t=3.85，8.63，P<0.05；②Compared with I/R group，t=2.36—7.52，P<0.05.Fig.2 The mRNA expression and semi-quantitative analysis of Bax and Bcl-2 in six groups of rats

3 讨论

心肌缺血发生后，氧和能量供应障碍会导致乳酸和磷酸盐等大量堆积，影响心肌正常功能，严重者损伤心肌细胞，造成细胞坏死等不可逆性改变。尽早进行再灌注治疗成为降低心肌损伤的有效方法，但需要注意的是血供改善后发生心肌损伤加重的情况，即心肌I/R损伤。中医药在心血管疾病的治疗中积累了大量的理论与实践经验。张仲景在《金匮要略》记载：“夫脉当取太过不及，阳微阴弦，即胸痹而痛”，胸痹病是对目前心血管疾病的概括，同时将辛温通阳法确立为胸痹的治则[9]。又《类证治裁·胸痹》言：“胸痹，胸中阳微不运，久则阴乘阳位，而为痹结也。”可见运用辛温的中药振奋心阳是医家们的共识。葱白作为辛温通阳的代表性中药，具有鼓舞心脉、温通心阳的作用。利用现代制剂技术，将FOB运用于临床，取得了较好疗效。临床观察发现，FOB在抗心肌缺血、降脂治疗方面疗效确切。现代研究发现FOB具有抗氧化，改善炎症反应，抑制内质网应激，减少细胞凋亡，发挥抗心肌I/R损伤的作用[10-12]。已有前期实验证实，FOB可通过降低I/ R心肌细胞内游离Ca2+浓度、调节p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路蛋白的表达来发挥改善I/R大鼠心功能作用。

A.假手术组；B.I/R组；C.FOB小剂量+I/R组；D.FOB中剂量+I/R组；E.FOB大剂量+I/R组；F.硝酸甘油+I/R组。①与假手术组比较，t=3.78，15.11，P<0.05；②与I/R组比较，t=3.05～7.81，P<0.05。图3 6组大鼠Cyt-C和Apaf-1的荧光表达及积分吸光度(n=10)A.sham group；B.I/R group；C.FOB low dose + I/R group；D.FOB medium dose + I/R group；E.FOB high dose + I/R group；F.nitroglycerin + I/R group.①Compared with sham group，t=3.78，15.11，P<0.05；②Compared with I/R group，t=3.05—6.78，P<0.05.Fig.3 Fluorescence expression and integral absorbance analysis of Cyt-C and Apaf-1 in six groups of rats(n=10)

细胞凋亡是I/R损伤发病的一个重要环节，细胞凋亡伴随着其发展的全过程，且成年心肌细胞是终末分化细胞，细胞的凋亡必将导致心肌收缩成分的丧失而影响I/R损伤的严重程度。与细胞凋亡相关的基因主要包括2种[13]：一种为前凋亡蛋白，有诱导细胞凋亡的作用，如Bax等；另一种为抗凋亡蛋白，与前者作用相反，可以通过与前凋亡蛋白结合发挥抗凋亡和细胞保护作用，如Bcl-2等。正常状态下，Bcl-2与Bax处于动态平衡，而当机体受外界影响，如I/R发生时，细胞内氧自由基增多和Ca2+超载等作用影响，Bcl-2与Bax平衡状态被打破，此时细胞核内促凋亡基因Bax高表达且蛋白表达随之上调，心肌细胞会启动凋亡程序[14-15]。细胞凋亡是一个程序性细胞死亡过程，Cyt-C在凋亡进程中发挥重要作用[16]。当Bcl-2/Bax蛋白表达比值下调，进而影响线粒体膜通透性，增加线粒体Cyt-C的释放，Cyt-C可与Apaf-1结合形成凋亡体多聚体复合物，启动并激活Caspase家族，引发Caspase级联瀑布式反应，因此Cyt-C与Apaf-1的激活是发生细胞凋亡的关键步骤[17]。本实验研究发现，FOB预处理首先改善了I/R损伤大鼠的心功能，并且在不同程度降低了CK、LDH和CK-MB水平，发挥了对心肌I/R损伤的保护作用；同时FOB不同剂量组均能够不同程度降低Bax蛋白及mRNA表达，同时明显增加Bcl-2 蛋白及mRNA表达，而参与凋亡进程的关键蛋白Cyt-C和Apaf-1表达也显著降低，表明FOB可以通过减少或抑制I/R损伤导致的心肌细胞凋亡，从而发挥抗心肌I/R损伤的作用。这也提示，抗心肌细胞凋亡是缓解I/R损伤、改善心功能的重要方法。

综上所述，本研究表明ROB预处理对心肌I/R损伤具有保护作用，其可能机制是通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达水平，从而降低凋亡相关因子Cyt-C和Apaf-1表达，最终减少心肌细胞凋亡而发挥其对心肌I/R损伤的保护作用。对心肌I/R损伤具有保护作用的最佳FOB浓度有待进一步研究。