癌痛方正丁醇提取物抑制癌性疼痛的分子机制*

黄鹤归，徐慧，黄贺达，杨全伟，黄小龙，覃双来，胡作为

(武汉市第一医院1.药学部；2.肿瘤科；3.呼吸内科，武汉 430022)

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位居所有恶性肿瘤之首。目前肺癌患者确诊时大多已是局部晚期或出现广泛转移，其5年生存率<20%，总体预后较差[1]。一直以来，化学治疗(化疗)是肺癌患者重要的治疗手段，虽然随着分子靶向治疗、免疫治疗、放射治疗(放疗)等研究的不断深入，具备更多的临床选择，但化疗作为最基础的治疗仍占据着不可忽视的位置。化疗在减少肿瘤负荷、延长生存期等方面具有重要意义，但尚不能令人满意。同时其细胞毒副作用和对生活质量的影响也成为了限制其应用的障碍[2]。中医药在治疗肿瘤及其相关疾病方面具有独特优势，笔者前期研究已证实“癌痛方”可抑制肺癌患者肿瘤生长；动物研究也证实其对醋酸所致小鼠疼痛具有显著镇痛作用，并能降低白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)含量[3-5]。但癌痛方抑制癌性疼痛(癌痛)的物质基础及其作用机制尚未阐明，有待进一步深入研究。本研究对癌痛方进行正丁醇部位提取，将其作用于Lewis肺癌小鼠模型，观察癌痛方正丁醇提取物(n-butanol extracts，BTE)对癌痛的影响，并进一步阐释其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠25只，4～6周龄，体质量18～20 g，由湖北省动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018，使用许可证号：SYXK(鄂)2017-0067，并在湖北中医药大学动物实验中心SPF级实验室适应性喂养7 d，保证室温22～26 ℃，相对湿度40%～60%，明暗交替12 h，自由饮水、采食。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2试药 Lewis肺癌细胞株(湖南丰晖生物科技有限公司，货号：CL0194)。癌痛方所含药物组成：重楼( Paridis Rhizoma)10 g(产地：云南)、川乌(Aconitum carmichaeli Debx)3 g(产地：四川)、蟾酥(Venenum Bufonis)0.02 g(产地：湖北)(湖北天济药业有限公司)，所有药材经武汉市第一医院余南才教授鉴定均符合《中华人民共和国药典》2020 版一部的要求。试剂：β-Actin(批号：ab37168)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)(批号：ab189786)、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(phosphorylated c-AMP response element binding protein，p-CREB)(批号：ab32096)购于美国Abcam公司。5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BRDU)(批号：66241-1)购于三鹰公司，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)试剂盒(批号：11684817910)购于Roche公司。

1.3仪器 奥林巴斯IX51倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)、成像系统(QImaging公司)、RM2016切片机(上海徕卡仪器有限公司)、DR-200Bs酶标检测仪(Diatek公司)。

1.4实验方法

1.4.1癌痛方正丁醇有效部位提取 将重楼、川乌及蟾酥碎后过孔径2.00 mm(10目)药筛，并按10：3：0.02比例称取药材总质量为130.20 g，并用20倍体积质量比70%乙醇溶液在室温下渗漉桶中浸泡36 h，按1.0 mL·min-1·kg-1速度渗漉提取，将渗漉液减压浓缩至密度为1.03 g·mL-1，用分液漏斗依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，并将正丁醇萃取液进行浓缩、干燥后称质量为5.20 g。

1.4.2肺癌小鼠皮下移植瘤模型及给药 采用已建立Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型[6]，接种14 d后(瘤体积约为150 mm3)，应用随机数字表分组，共2组，每组10只，即BTE组、模型对照组。BTE组将BTE用0.9%氯化钠溶液稀释后给予0.2 mL灌胃(生药量计算为1.97 g·kg-1·d-1)；模型对照组：0.9%氯化钠溶液0.2 mL灌胃。各组每日给药1次，共计14 d。

1.4.3肿瘤体积抑制率 在末次给药后24 h，对移植瘤小鼠处死，于超净工作台剥离出肿瘤组织并称质量，计算抑瘤率(IR)。肿瘤体积抑制率(tumor volume inhibition percentage，TVI%)=(模型对照组肿瘤平均体积-BTE组肿瘤平均体积)/模型对照组肿瘤平均体积×100%。

1.4.4肿瘤组织形态学改变 取部分肿瘤组织在4%低聚甲醛溶液中固定，然后进行石蜡包埋。准备组织切片(厚度5 μm)，并使用苏木精-伊红(HE)进行常规染色。在奥林巴斯CX-51光学显微镜观察并摄相。

1.4.5肿瘤组织凋亡水平 将石蜡组织切片，按照罗氏公司TUNEL试剂盒操作说明书步骤处理，分别进行TUNEL染色和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色，在荧光显微镜下观察并摄相。

1.4.6肿瘤组织增殖情况 将石蜡组织切片，按照BRDU法检验操作步骤进行处理[7]。荧光显微镜下观察，并量化BRDU阳性细胞的密度。

1.4.7肿瘤组织中CGRP/p-CREB信号通路改变 肿瘤组织块用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂，将匀浆液转移至离心管中，冰上裂解组织，离心5 min，收集上清液，使用2，2'-联喹啉-4，4'-二甲酸二钠(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度，确定上样量，沸水变性。按照Western blotting操作步骤[8]，并使用AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的吸光度。

2 结果

2.1BTE对Lewis肺癌小鼠肿瘤质量、体积的影响 结果见表1。与模型对照组比较，BTE组小鼠的肿瘤质量下降，体积缩小(均P<0.05)。

表1 2组小鼠肿瘤质量及体积比较Tab.1 Comparison of tumor mass and volume between two groups of mice

2.2BTE对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织形态学影响 结果见图1。肿瘤组织HE染色发现，模型对照组肿瘤组织细胞分布均匀致密；BET处理后，肿瘤组织部分细胞肿胀及细胞核固缩。

A.模型对照组；B.BTE组。图1 2组小鼠肿瘤组织HE染色结果(×400)A.model control group；B.BTE group.Fig.1 HE staining of tumor tissue in two groups of mice(×400)

2.3BTE对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织凋亡水平影响 模型对照组肿瘤组织中TUNEL阳性细胞数比例为(6.71±1.84)%，BTE组小鼠肿瘤组织中TUNEL阳性细胞数比例为(18.00±2.74)%，2组差异有统计学意义(t=17.95，P<0.01)。结果见图2。

A.模型对照组；B.BTE组。图2 2组小鼠肿瘤组织TUNEL染色结果(×400)A.model control group；B.BTE group.Fig.2 TUNEL staining of tumor tissue in two groups of mice(×400)

2.4BTE对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织增殖水平影响 结果见图3。模型对照组肿瘤组织中BRDU阳性细胞比例为(76.67±8.36)%，BTE组小鼠肿瘤组织中BRDU阳性细胞比例为(31.94±6.77)%，2组差异有统计学意义(t=29.69，P<0.01)。

A.模型对照组；B.BTE组。图3 2组小鼠肿瘤组织BRDU染色结果(×400)A.model control group；B.BTE group.Fig.3 BRDU staining of tumor tissue in two groups of mice(×400)

2.5BTE对CGRP及p-CREB蛋白表达影响 结果见图4。与模型对照组比较，BTE组小鼠肿瘤组织CGRP及p-CREB蛋白水平均显著降低(P<0.05，P<0.01)。

A.模型对照组；B.BTE组。 ①与模型对照组比较，t=3.62，P<0.05；②与模型对照组比较，t=5.72，P<0.01。图4 2组小鼠肿瘤组织中CGRP及p-CREB蛋白表达A.model control group；B.BTE group；①Compared with model control group，t=3.62，P<0.05；②Compared with model control group，t=5.72，P<0.01.Fig.4 Expression of CGRP and p-CREB proteins in the tumor tissues of two groups of

3 讨论

癌痛方是我院临床治疗肿瘤常用的经验方，具有散结消肿、通络止痛的功效。方中川乌温经散寒，通络止痛；重楼清热解毒，消肿止痛；蟾酥解毒，消肿，止痛。研究证实川乌中乌头碱可用于治疗多种癌症，如肝癌、肺癌、前列腺癌等，并可提高癌症化疗效果及减缓患者治疗后的疼痛[9]。甾体皂苷是重楼主要活性成分[10]。重楼总皂苷对HepG2细胞具有一定的放疗增敏作用，其机制可能与抑制细胞增殖、调节细胞周期、促进细胞凋亡、降低MUC-1 蛋白的表达有关[11]。研究证实，重楼皂苷I可通过线粒体介导的细胞凋亡通路快速诱导细胞凋亡，且呈现剂量依赖性[12]。本研究发现，BTE能诱导Lewis肺癌小鼠肿瘤质量降低，肿瘤体积缩小；同时，形态学研究发现其可以诱导肿瘤细胞肿胀变形及细胞核固缩；进一步研究发现BTE能促进肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖。提示BTE能够抑制肺癌细胞增殖，促进凋亡，发挥抑制肿瘤细胞作用。

CGRP感觉神经元形成一个C类纤维亚群，该亚群参与疼痛传导，并与突破痛的发生有关。CGRP及其受体在肺神经内分泌细胞中高表达，其参与了肺癌及癌痛的发生、发展[13]。CREB是碱性亮氨酸拉链超家族的一种转录因子，参与调节多种生理过程[14]；其在肿瘤细胞增殖、存活及转移中也发挥重要作用[15]。肿瘤微环境改变可以促进CGRP及其下游p-CREB在Lewis肺瘤组织中感觉神经兴奋性及痛觉[16]。笔者前期研究发现癌痛方对醋酸所致小鼠疼痛具有显著镇痛作用[3]。本研究发现BTE能下调Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中CGRP和CREB蛋白水平，提示CGRP/p-CREB信号通路抑制可能介导了BTE抑制癌痛作用。

综上所述，癌痛方BTE能抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞增殖、促进其凋亡，并具有镇痛作用。CGRP/p-CREB信号通路抑制可能介导了BTE抑制癌痛作用。本研究为癌痛方抑制癌痛及临床应用供了实验依据。