7,8-二羟基黄酮对人脑皮质神经元细胞增殖、凋亡影响以及临床意义

王坤

（齐齐哈尔医学院附属第二医院 神经内科，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

0 引言

糖尿病、高血压等因素导致的出血性脑中风（Intracerebral hemorrhage,ICH）发病率和死亡率高[1]。即使ICH患者存活，也常出现神经功能缺损或障碍，生存质量造成严重影响。

对ICH实施有效的神经元保护，是缓解ICH损伤，维持患者神经系统功能的关键。NGF、BDNG等神经营养因子家族成员对维持神经元功能具有重要作用。BDNF能够改善ICH疾病预后，逆转神经元损伤[2]。但是这些神经营养因子含量低，制备工艺比较复杂，如果能找到与BDNF具有相似作用，对神经元具有保护作用的替代物，将有效保持ICH神经元的功能，促进患者康复。

7,8-二羟基黄酮（7,8-dihydroxyflavone，DHF）可以活化PI3K/Akt信号路径，促进结肠平滑肌蠕动改善便秘[3]；腹腔注射DHF能够恢复阿尔兹海默病ICV-STZ大鼠模型的中枢神经系统线粒体功能障碍，发挥较好的神经保护作用[4]。尽管DHF具有类似BDNF的结构，但是DHF激活通过何种分子机制发挥对ICH神经元的保护作用还不清楚。观察DHF对人脑神经元细胞的保护作用和潜在分子机制，为指导神经元保护奠定研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人脑皮质神经元细胞（Procell公司）。

1.1.2 主要试剂和仪器

人神经元专用完全培养基（Procell公司），Triciribine（Sigma-Aldrich公 司），DHF（日 本TCI公司），CCK-8试剂（日本Dojindo公司）、AnnexinⅤ-FITC（上海碧云天生物科技公司），FACSAriaⅡ流式细胞仪（BD公司），人TrkB、Akt、磷酸化Akt蛋白的ELISA试剂盒（R&D公司）。日本OLYMPUS倒置显微镜，Thermo公司的Multiskan FC酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 人神经元细胞培养与分组

人神经元专用完全培养基培养人脑皮质神经元细胞。第3-5代细胞进行实验，这些细胞未出现死亡等现象。无任何刺激进行培养的神经元细胞为对照组。35μmol/L DHF刺激神经元细胞为DHF组；若同时加入10μmol/L Triciribine者为Akt抑制剂组。

1.2.2 CCK-8实验

7.50×103人脑皮质神经元细胞种植到96孔细胞培养板，37˚C，5%CO2培养12h。按实验分组添加相应试剂，同时添加10µl CCK-8试剂，37˚C，5%CO2培养4h。Multiskan FC酶标仪于450 nm测量吸光度值（Absorbance value，A值）。

1.2.3 流式细胞凋亡实验

0.25%胰酶-EDTA溶液消化各组细胞，5.5×105各组细胞以12.5ml/L（体积比）AnnexinⅤ-FITC溶液重悬孵育15min；4℃，1000r/min离心5min，加入20g/L碘化丙啶孵育3min；4℃，0.01mmol/L PBS悬浮细胞。FACSAriaⅡ流式细胞仪检测细胞凋亡数目。

1.2.4 ELISA

9.0×106各组细胞，4℃，以RIPA蛋白裂解液裂解并提取蛋白质；BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度，每组30μg蛋白用于ELISA检测。人Akt、磷酸化Akt蛋白的ELISA试剂盒检测各组细胞裂解液中Akt(312.0-20,000 pg/mL)、磷酸化Akt蛋白(156.0-10,000 pg/mL)蛋白含量。

1.2.5 统计学分析

GraphPad_Prism 8.0.2.263软件分析数据，计量资料采用单因素方差分析，两两间比较采用Q检验。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 DHF促进人脑皮质神经元细胞增殖

CCK-8实验发现，对照组、DHF组和Akt抑制剂组人脑皮层神经元细胞增殖A值相比，数据具有明显差异（P<0.01）。相对于对照组和Akt抑制剂组，DHF组人脑皮层神经元细胞增殖A值显著增高（P<0.01）；相对于DHF组，Akt抑制剂组人脑皮层神经元细胞增殖A值显著降低（P<0.01），见表1。

表1 各组人皮层神经元细胞A值、凋亡数目的比较（，n=6）

表1 各组人皮层神经元细胞A值、凋亡数目的比较（，n=6）

注：*P<0.01，与对照组相比；#P<0.01，与DHF组相比。

2.2 DHF抑制人脑皮质神经元细胞凋亡

流式细胞凋亡实验发现，对照组、DHF组和Akt抑制剂组人皮层神经元细胞凋亡数目相比，具有明显差异（P<0.01）。相对于对照组和Akt抑制剂组，DHF组人皮层神经元细胞凋亡数目明显降低（P<0.01）；相对于DHF组，Akt抑制剂组人脑皮层神经元细胞凋亡数目显著增多（P<0.01），见表1。体外实验说明DHF能够促进人脑皮层神经元细胞增殖，抑制其凋亡。

2.3 DHF对Akt、磷酸化-Akt蛋白含量的影响

对照组、DHF组和Akt抑制剂组人脑皮层神经元细胞Akt、磷酸化-Akt蛋白含量有显著差异（P<0.01）。与对照组相比，DHF组Akt、磷酸化-Akt蛋白含量均明显增高（P<0.01），相对于DHF组，Akt抑制剂组的Akt、磷酸化-Akt蛋白含量均明显降低（P<0.01），表2。

表2 各组人皮层神经元细胞Akt、P-Akt蛋白含量的比较（，pg/mL，n=6）

表2 各组人皮层神经元细胞Akt、P-Akt蛋白含量的比较（，pg/mL，n=6）

注：*P<0.01，与对照组相比；#P<0.01，与DHF组相比。

3 讨论

出血性脑中风（ICH）发病率和死亡率逐年升高[5]。即使出血性脑中风（ICH）患者存活，也常伴随着长期的神经功能障碍。研究发现，7,8-二羟基黄酮（DHF）结构与BDNF相似，皆与TrkB结合，引起TrkB磷酸化，有效活化其下游PI3K/Akt、MAPK/Erk信号传递路径以对抗细胞凋亡[6]；动物实验腹腔注射DHF后2小时，能有效活化脑神经细胞上TrkB而抑制细胞凋亡[4]。以DHF取代BDNF的作用活化TrkB，在临床抗高血压、保护神经细胞、并能有效改善脑神经损伤压力与老化所造成的记忆功能缺损、运动神经伤害等问题，但是DHF对脑出血性脑损伤的保护作用，DHF能否改善ICH造成的神经细胞凋亡还需要进一步研究。

为了研究DHF对ICH神经元细胞的保护效果，利用CCK-8实验发现，对照组、DHF组和Akt抑制剂组三组人脑皮层神经元细胞增殖A值具有显著差异。相对于对照组和Akt抑制剂组，DHF组人脑皮层神经元细胞增殖A值最高；相对于DHF组，Akt抑制剂组人脑皮层神经元细胞增殖A值显著降低（P<0.01）。在一项评价7,8-二羟基黄酮(DHF)对过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)引起PC12细胞损伤的研究中，也采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测PC12细胞活力，AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶双染法结合流式细胞仪观察并分析PC12细胞凋亡情况。结果发现，DHF可以减轻H2O2引起的PC12细胞损伤，促进PC12细胞增殖，抑制其凋亡[7]。本实验研究结果与这些学者的研究相符，均证明DHF能够促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，对细胞具有一定保护效果。此外，本实验还发现DHF组Akt、磷酸化Akt蛋白明显高表达，在Akt信号通路与FUS相互作用关系的研究中，证实了FUS通过AKT通路促进内皮祖细胞增殖并介导其自噬[8]。EGFR能够活化PI3K-Akt信号通路，促进精原母细胞瘤细胞增殖和迁移[9]。若阻断PI3K-Akt-BCL-2信号通路，可以减轻SD大鼠大肠癌发生和发展[10]。本实验的结果提示DHF作用的ICH能够显著修复或改善ICH神经元损伤。研究结果将为开展神经元保护，促使ICH患者康复提供有效的靶向修复思路。体外实验也发现，DHF作用的人皮质神经元细胞增殖水平明显升高，其凋亡能力显著降低，更证实了DHF能够通过Akt信号通路调控人皮质细胞增殖和凋亡，与实验的预期结果相符。本实验在细胞水平进行初步探索，还缺少体内动物实验的相关证据，后期将利用大鼠ICH模型，进一步观察DHF对ICH神经元的保护作用。