82例卵巢癌患者胚系BRCA1/2基因突变分析及预后探索*

孙国栋，孟黄洋，姜旖，袁琳，周树林，程文俊

210029 南京，南京医科大学第一附属医院 妇科

卵巢癌约占全球女性死亡的4%，是死亡率最高的妇科恶性肿瘤[1]。绝大多数卵巢恶性肿瘤是上皮性卵巢癌，大多数患者发现时已是FIGO III/IV期,晚期卵巢癌患者的5年生存率仅为30%。目前，晚期上皮性卵巢癌的标准治疗是最大程度的肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为基础的化疗。尽管大多数卵巢癌患者可以从铂类为基础的一线化疗中受益，但约80%的患者将在1～2年内复发，逐渐发展为铂耐药性卵巢癌[2]。因此，延长无进展生存期从而提高5年生存率是一个亟待解决的问题。

BRCA基因为重要的DNA同源修复基因，其突变会导致同源重组缺陷，从而损害基因稳定性并导致癌变。已有大量报道提示BRCA1/2突变的患者对化疗的反应更好[3]。PARP抑制剂为BRCA突变患者的靶向药物，在一线及二线维持治疗方面已取得了显著的成效。可以说，卵巢癌的治疗已经进入了PARP抑制剂维持治疗的新时代。而我国的卵巢癌BRCA基因检测尚在起步阶段，缺乏更大规模的多中心临床研究。在这里，我们使用二代测序技术研究了本中心的卵巢癌患者胚系BRCA1/2突变特征，进一步阐明其与临床病理特征的关系，初步探索其对预后的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究回顾性分析了2015年1月至2020年1月在南京医科大学第一附属医院妇科接受治疗，经初始肿瘤细胞减灭术或新辅助化疗后行间歇性肿瘤细胞减灭术，病理确诊的上皮性卵巢癌患者。化疗方案均为紫杉醇+铂类的TP方案。收集这些患者的高通量二代测序技术的胚系BRCA1/2基因检测结果及临床病理学资料。所有患者均签署知情同意书。

1.2 BRCA1/2基因检测方法

采集患者的血样送往基因检测公司或我院病理科进行检测。应用NGS技术检测所有编码外显子及其邻近±20 bp内含子区的BRCA1和BRCA2突变。使用特定的基因引物从原始样本开始使用Sanger DNA测序来确认所有报道的变异。对突变的分类采用公认的5类分类：已知致病突变、疑似致病突变、意义未明突变、疑似良性变异、良性多态性变异。数据解读规则和致病报道参考美国医学遗传学和基因组学学院(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相关指南、乳腺癌信息核心数据库(https://research.nhgri.nih.gov/bic/)、莱顿开放变异数据库(http://www.lovd.nl/)、ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)等数据库[4]。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0软件进行统计学处理。采用卡方检验或确切概率法分析基因突变与患者临床病理特征的关系。使用单因素及多因素COX回归分析各临床因素影响卵巢癌无进展生存期(progression-free survival,PFS)的差异，COX模型的PH假定均已验证。使用R软件中的Survival包做出Kaplan-Meier曲线描绘变量对于卵巢癌PFS的影响。以P<0.05为差异有统计学意义。

1.4 随访情况

随访由南京医科大学第一附属医院妇产科2名随访专员每年按时进行，随访方式包括：门诊、电话、微信、QQ、短信、信件等方式。随访时间为术后至患者死亡或60个月。随访过程中仅出现CA125升高而未出现影像学病灶，判定为生化复发；出现影像学病灶，判定为影像学复发。PFS为末次化疗结束至影像学复发时间。结束铂类药物末次化疗后12个月以上复发判定为铂完全敏感复发，6～12个月判定为铂部分敏感，6个月以内判定为铂耐药，从初始治疗开始就未达到疾病缓解的患者判定为铂难治。随访情况由专人登记。

2 结 果

2.1 患者的突变分析

共纳入82例上皮性卵巢癌患者，共发现BRCA1致病性突变17例，突变率为20.73%，BRCA2致病性突变8例，突变率为9.75%，总突变率为30.48%。共检测到BRCA1致病突变位点13个，其中c.2160delA、c.3770_3771delAG、c.5470_5477delATTGGGCA、c.3255_3259del(p.Leu1086fs)、c.3294del(p.pro1099fs)、c.4782del(p.Ser1595fs)、c.587dupA(p.Tyr196fs)、c.4065_4068delTCAA、c.4132delG这9个位点为移码突变，其次c.3967C>G、c.1115G>A、c.4801A>T、C.6528C>G为错义突变。BRCA2共检测到7个致病突变，c.1495C>T、c.6528C>G、c.2041G>A、c.4593dupA为错义突变,c.1499del(p.Gly500fs)、c.3770_3771dell(p.Glu1257fs)、c.6405_6409delCTTAA为移码突变。其中c.4132delG位点、C.6528C>G位点临床意义未明，无文献报道，可能具有潜在的研究价值(表1)。

表1 25例胚系基因BRCA1/2突变位点及突变类型

2.2 患者的突变状态与临床病理分析

82例均为上皮性卵巢癌患者，其中I～II期12(14.6%)例，III～IV期70(86.4%)例；病理类型因素中，74例浆液性癌(90.2%)，8例非浆液性癌(9.8%)，具体为:5例透明细胞癌、3例子宫内膜样癌；行新辅助化疗患者42例，均为IIIC期及IV期患者。通过后期随访发现，82例患者中，31例(37.8%)为铂完全敏感，32例(39%)为部分敏感；16例(19.6%)患者为铂耐药，3例(3.6%)患者为铂难治；经影像学或术后病理确诊，34例(41.5%)患者存在淋巴结转移；49例(59.8%)患者有大网膜饼转移；31例(37.8%)患者有膈顶转移；21例(25.6%)患者存在结直肠侵犯；术前CA125值>500U/mL者51(62.2%)例。BRCA野生型组与突变组患者发病年龄、月经状态、临床分期、组织分化等临床因素比较差异无统计学意义(P>0.05)。BRCA1/2基因致病突变状态与病理类型、是否铂敏感、是否新辅助化疗相关，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05,表2)。

表2 BRCA基因突变与临床病理特征的关系

2.3 患者的突变状态与预后分析

在对PFS相关的单因素Cox回归分析中，只有BRCA1/2突变状态(P=0.030;HR=0.43;95%CI:0.20～0.94)、大网膜饼(P=0.021;HR=2.27;95%CI:1.13～4.54)、侵犯结直肠(P=0.001;HR=2.87;95%CI:1.51～5.48)、是否铂敏感(P<0.001;HR=0.02;95%CI:0.01～0.06)、是否新辅助化疗(P=0.015;HR=2.24;95%CI:1.17～4.31)是有意义的预后因素(表3)。相应的生存曲线图如图1所示。BRCA突变组中位PFS为18.6个月，无突变组为12.8个月(P=0.030)。随后将这5个因素纳入多因素COX回归分析中显示，铂敏感(P<0.001;HR=0.02;95%CI:0.01～0.07)和是否存在结直肠侵犯(P=0.005;HR=2.81;95%CI:1.39～5.69)为卵巢癌PFS的独立预后因素。然而，BRCA突变状态并非是卵巢癌PFS的独立预后因素(表4)。

表3 82例卵巢癌临床病理与PFS的单因素COX回归分析

表4 82例卵巢癌临床病理与PFS的多因素COX回归分析

图1 卵巢癌临床病理特征与PFS的关系

3 讨 论

近年来，许多研究揭示了BRCA1/2在DNA损伤修复机制中发挥的重要作用。BRCA1/2突变在具有潜在同源重组缺陷的细胞中可诱导合成致死[5]。BRCA基因的单核苷酸多态性和突变是导致BRCA基因结构和功能异常的主要原因[6]。目前临床对携带BRCA1/2突变的卵巢癌患者，特别是晚期复发的卵巢癌患者往往采取个性化的治疗措施[7]。除了手术和化疗，临床上更倾向于口服PARPi药物作为一线的维持治疗或复发后化疗达到CR/PR的维持治疗。虽然BRCA1/2突变的状态对卵巢癌的临床决策和预后很重要，但中国目前尚处在探索阶段，需要更多多中心的临床研究进入临床实践。

本研究描述了本中心82例行基因检测的上皮性卵巢癌患者BRCA突变状态，与常见的临床病理因素间的关系以及对预后的影响。在我们的研究中，总突变率为30.48%，其中BRCA1突变率为20.73%，BRCA2突变率为9.75%，与一项卵巢癌患者BRCA突变系统性分析的结果基本符合(BRCA1和BRCA2的基因突变率分别为1.1%～39.7%和0～13.9%[8]，总突变率略高于王登凤等[9]报道的突变频率，其中，BRCA1的突变频率与吴小华教授报道的20.82%相仿[10]。BRCA1/2基因突变类型包括移码突变、无义突变、错义突变、同义突变及剪切突变5种类型，对蛋白质的编码起到重要作用[11]。本研究中BRCA1共检测到9种移码突变，4种错义突变，BRCA2共检测到3种移码突变，4种错义突变。移码突变和错义突变均会导致BRCA编码的蛋白质出现一级结构的改变，进而引起相关编码蛋白质功能发生改变或失活。根据目前的资料，这些变异会影响BRCA功能从而导致卵巢癌的发生发展。而c.4132delG位点、C.6528C>G位点临床意义未明，无文献报道，有待在今后工作中进一步加深研究。

同时，本研究发现BRCA的致病突变组主要的病理类型为浆液性卵巢癌，且大多对铂敏感，采取新辅助化疗的比例更大(表2)。许多学者认为BRCA突变相关的卵巢癌的病理类型大多都是高级别的浆液性卵巢癌。一项研究结果显示在BRCA突变相关卵巢癌的患者中高级别浆液性癌的比例为60%～83%，而在BRCA1突变的患者中，这个比例更高[12-13]。这与我们的结果相一致。而BRCA突变的卵巢癌患者的铂敏感性更是得到了广泛的认可,“合成致死”原理揭示了其内在机制[14]。因此BRCA突变的卵巢癌患者对铂类化疗药物为基础的一线化疗方案具有更好的反应性和生存获益。基于上述分析，BRCA突变的卵巢癌大多为高级别浆液性癌，诊断时临床期别通常较晚，手术难度更大，选择新辅助化疗后行间歇性肿瘤细胞减灭术似乎成为了更为倾向的选择。

目前大多数学者普遍认为携带BRCA突变的卵巢癌患者预后更好，总生存时间和无进展生存时间较长。Helpman等[15]发现，BRCA突变组的OC患者的无进展生存期突变组(46.2个月)较无突变组(37.7个月)显著延长,还有一些研究得出相似结论[16-17]。而Bu等[18]的研究则提出无进展生存期突变组(14.31个月)较无突变组(13.62个月)无显著延长(P>0.05)，但3年和5年生存率有显著差异。在本研究中，BRCA突变组的中位PFS为18.6个月，较无突变组的12.8个月显著延长。虽然多因素COX回归分析显示BRCA突变状态并非卵巢癌患者PFS的独立预后因素，但考虑到铂敏感为卵巢癌患者PFS的独立预后因素，且本研究的样本量仍较小，因此我们仍期待在后续的研究中扩大样本量，进一步探究BRCA突变状态是否可作为卵巢癌患者PFS的独立预后因素。

这项研究有几个局限性。首先由于该研究是基于本中心接受手术的卵巢癌基因检测报告进行的研究，检测时间距离随访终点时间较近，存在明显的幸存者偏倚，故本研究无法进行总生存率OS的统计。在后续的研究中，我们在扩大样本量的过程中，可以增加总生存率的统计。其次，本研究的样本量较小，仍需要扩大样本量以及进行更多的临床和基础研究揭示其内在机制。

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