M2型肿瘤相关巨噬细胞在胰腺癌组织中的表达及其与预后的关系*

陈凯，廖芮，杨洪吉，朱世凯，杨冲，董丹丹，李科，李有赞

610072 成都，四川省人民医院，电子科技大学 器官移植中心(陈凯、杨洪吉、朱世凯、杨冲)，病理科(董丹丹、李科)； 646099 四川 泸州，西南医科大学 临床医学院(廖芮、李有赞)

胰腺癌临床表现隐匿、早期诊断困难、临床预后极差，且全球范围内发病人数和病死率呈不断上升的趋势[1-2]，其中位生存时间6～9个月，1年生存率约18%，5年生存率仅约5%[3-4]。胰腺癌的病因及生物学行为复杂，探讨胰腺癌侵袭及转移过程的有关分子机制，对提高胰腺癌的治疗效果具有重要的理论及临床意义。巨噬细胞是机体固有免疫系统中重要的组成部分，通过直接杀伤或诱导机体免疫应答的方式清除肿瘤细胞，广泛参与体内固有免疫和适应性免疫[5]。然而巨噬细胞在肿瘤微环境中也可发挥负向调控作用，可促进肿瘤细胞生长、抑制T淋巴细胞和NK细胞抗肿瘤活性，在肿瘤侵袭和转移中起重要作用，将其称之为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)[6-7]。根据细胞自身及活化微环境的多样性，TAMs又分为经典活化的巨噬细胞型M1型(抗肿瘤)和替代激活的M2型(促肿瘤)[8]。然而M2型TAMs在胰腺癌侵袭转移中的作用机制尚不明确，本研究通过免疫组织化学的方法，分析胰腺癌组织中巨噬细胞的表达及其与临床病理特征之间的关系，探讨其对患者预后的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象来自2017年1月至2019年12月在四川省人民医院器官移植中心接受手术治疗的208例胰腺导管腺癌患者。纳入标准：1)术后病理证实为胰腺导管腺癌；2)在我院首治患者，且术前未进行过放疗、化疗及抗炎治疗等；3)行胰十二指肠切除术或胰体尾切除术；4)患者临床病理及术后随访资料完整。本研究全部患者的知情同意均已获得，且通过了四川省人民医院伦理委员会的审查，符合伦理学要求。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集 通过病案管理系统采集患者入院时的基线资料，包括性别、年龄、既往疾病史等，记录患者临床病理特征，包括手术方式、肿瘤部位、临床分期、肿瘤病理类型、分化程度、淋巴结转移、血管侵犯等。

1.2.2 免疫组化染色及结果判定 所有手术标本均常规石蜡包埋、切片，行免疫组织化学染色，首先采用鼠抗人CD68和CD163单克隆抗体单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司产品)，采用Envision二步法试剂盒和二氨基联苯氨(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司产品)按照说明书进行操作。结果判断：采用半定量法，在低倍视野下找到10个CD68和CD163阳性细胞聚集最多的热点区域，在高倍视野下对热点区域的TAMs细胞进行计数，并根据染色程度和着色细胞百分比进行结果判定。染色程度：不着色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分；着色阳性细胞占计数细胞百分比<5%计0分、5%～25%计1分、>25%～50%计2分、>50%计3分；将两项得分相加作为总分，总分0～1分为阴性(-)、2～3分为低表达(+)、4～5分为中表达(++)、6分为高表达(+++)，统计时将低、中、高表达归入阳性表达组。

1.2.3 随访 术后采用电话随访、门诊复诊的方式对患者术后生存情况进行随访以获取患者的总生存期(overall survival,OS)，随访截止日期为2020年12月31日，OS是指从手术之日起至死亡或随访截止时所经历的时间。患者拒绝随访或因各种原因无法联系者视为失访。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学处理。对符合或近似符合正态分布的计量资料采用均数±标准差进行统计描述，组间比较采用两独立样本的t检验；计数资料采用率或构成比[n(%)]进行统计描述，组间比较采用χ2检验；双向有序变量之间的相关性检验采用两组或多组独立样本的秩和检验；采用Kaplan-Meier法进行生存分析，生存期的单因素比较采用Log-rank法，采用多因素Cox比例风险回归模型分析影响患者预后生存的独立危险因素。以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床病理特征

本研究共纳入胰腺导管腺癌患者208例，其中男性92例(44.2%)、女性116例(55.8%)；年龄41～77岁，平均年龄(58.8±7.7)岁；肿瘤部位：胰头129例(62.0%)、胰体尾79例(38.0%)；分化程度：高分化50例(24.0%)、中分化87例(41.8%)、低分化71例(34.1%)；肿瘤平均大小(3.1±0.6)cm，≤2 cm者67例(32.2%)、>2cm者141例(67.8%)；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期62例(29.8%)、Ⅲ～Ⅳ期146例(70.2%)；淋巴结转移137例(65.9%)，血管侵犯75例(36.1%)。

2.2 胰腺癌组织中CD68、CD163的蛋白表达

CD68及CD163的蛋白表达主要定位于胞质，两者染色均呈为棕黄或棕褐色，见图1、2。CD68和CD163的阳性表达率分别为84.1%(175/208)和76.0%(158/208)。

图1 胰腺癌组织中CD68的表达(免疫组化染色，×100)

图2 胰腺癌组织中CD163的表达(免疫组化染色，×100)

2.3 CD68、CD163的表达与临床病理特征的关系

CD68的阳性表达与肿瘤临床分期密切相关，肿瘤临床分期越晚其阳性表达率也越高(P<0.05)；CD163的阳性表达与肿瘤临床分期、肿瘤大小密切相关，临床分期越晚、肿瘤越大其阳性表达率也越高(P<0.05;表1)。

表1 CD68、CD163的表达与临床病理特征的关系

2.4 CD68、CD163双表达与临床病理特征的关系

将208例胰腺癌患者依据其CD68、CD163双表达情况分为4组：CD68-/CD163-组24例(11.5%)、CD68-/CD163+组62例(29.8%)、CD68+/CD163-组47例(22.6%)、CD68+/CD163+组75例(36.1%)。结果显示，CD68+和CD163+双表达与肿瘤临床分期、肿瘤大小密切相关，临床分期越晚、肿瘤越大其双阳性表达率也越高(P<0.05;表2)。

表2 CD68、CD163双表达与临床病理特征的关系

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Clinicopathological parameterCD68-CD68+CD163-(n)CD163+(n)CD163-(n)CD163+(n)χ2/ H/ZPTumor site0.833a0.842 Head of pancreas13383048 Tail of pancreas11241727Degree of differentiation0.512c0.774 Highly differentiated8141117 Moderately differentiated9272031 Poorly differentiated7211627Clinical stage-3.454b0.001 I-II11211218 III-IV13413557Lymph node metastasis-0.132b0.895 No9201725 Yes15423050Vascular invasion-0.304b0.761 No14412949 Yes10211826

2.5 影响胰腺癌患者预后生存的单因素及多因素分析

单因素分析显示，肿瘤大小、临床分期及CD68、CD163阳性表达均与患者的预后生存相关(P<0.05)。进一步的多因素分析显示，肿瘤大小>2 cm、临床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68阳性表达是影响胰腺导管腺癌患者预后生存的独立危险因素(P<0.05;表3。)

表3 胰腺癌患者预后生存的单因素及多因素分析

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FactorUnivariate analysisMultivariate analysisHR(95%CI)χ2PHR(95%CI)χ2PLymph node metastasis No13.6000.05812.9590.085 Yes1.028 (0.996-1.060)1.004 (0.992-1.016)Vascular invasion No12.0580.151 Yes1.468 (0.869-2.481)CD68 Negative11 Positive3.347 (1.518-7.378)10.5070.0012.754 (1.249-6.072)6.3090.012CD163 Negative11 Positive2.121 (1.030-4.368)4.1640.0412.091 (0.926-4.722)3.1480.076

3 讨 论

胰腺导管腺癌与其它实体肿瘤一样，肿瘤间质中包含了很多浸润性免疫细胞，这其中TAMs占大多数，然而巨噬细胞具有很大的异质性，在肿瘤微环境中可作为免疫系统负向调控因素，绝大部分的TAMs被激活为M2型TAMs，抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性，产生大量抗炎因子，促进肿瘤细胞的增殖发展。肿瘤组织内或者癌周浸润的高密度M2型TAMs往往伴随着不良的预后。TAMs作为重要的免疫细胞，在胰腺肿瘤的发生、侵袭、转移过程中同样发挥着重要作用。Wei等[9]报道，97例非功能性胰腺神经内分泌肿瘤TAMs浸润与术后复发关系密切，CD68评分高是其复发的重要预后因素。Song等[10]报道，151例非功能性胰腺神经内分泌肿瘤TAMs的高表达与淋巴结转移、高Ki-67指数等相关。但目前针对M2型TAMs与胰腺导管腺癌的关系尚不十分明了。

本硏究采用免疫组织化学法检测由CD68、CD163标记的M2型TAMs在胰腺导管腺癌组织中的浸润表达情况，发现CD68和CD163的阳性表达率分别为84.1%和76.0%。王梦一等[11]的研究显示，CD68、CD163在胰腺癌标本呈现较高的阳性表达率，且主要聚集在肿瘤侵袭的边缘、淋巴管、血管和神经周围，其阳性表达率与肿瘤大小、临床分期、血管侵犯、淋巴结转移密切相关。CD68、CD163是预测肿瘤复发转移重要指标，可有效的评估多种肿瘤的复发风险[12-13]。本研究结果也显示，CD68、CD163的阳性表达与肿瘤临床分期、肿瘤大小相关。提示由CD68、CD163标记的M2型TAMs在胰腺癌侵袭、进展、转移中起重要作用，并与胰腺癌的恶性生物学行为有关，影响胰腺癌患者的预后。

丁军利等[14]、叶良涛等[15]对M2型TAMs在胰腺肿瘤患者癌组织中的表达及其与临床病理相关因素进行研究，发现CD68、CD163都具有较高的阳性表达率，且与肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯和临床分期等相关。本研究中对影响胰腺癌患者预后生存进行单因素及多因素分析显示，肿瘤大小>2 cm、临床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68阳性表达是影响胰腺导管腺癌患者预后生存的独立危险因素，危险比越大，预后死亡的风险越高。这就可以解释为何病理分级相同的患者，其预后之间可能存在巨大差异[16]，说明胰腺导管腺癌预后与多种危险因素的综合影响密切相关[17-18]，除了单纯的评估肿瘤本身临床病理因素外，还需要重点考虑肿瘤微环境对预后的影响[19-20]。

综上所述，M2型TAMs在胰腺导管腺癌组织中广泛浸润，CD68和CD163的阳性表达与肿瘤临床分期、肿瘤大小密切相关，肿瘤大小>2 cm、临床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68阳性表达是预测胰腺导管腺癌患者预后的独立危险因素。M2型TAMs可作为胰腺导管腺癌预后的潜在分子标志物。后续研究中，可以进一步深入研究其相关调节机制可能为胰腺癌的治疗提供新的思路。

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