酶解法提取花生壳黄酮及其抗氧化性、抑菌性研究

杜蕾，谷令彪，位子昂，高会会，张光杰

(安阳工学院，河南 安阳 455000)

花生，又名长生果，一年生草本植物，在我国很多地区均有种植，是重要的油料作物和经济作物。近几年，我国花生年均产量可达1700万吨以上，与此同时也会产生大量的花生壳等加工副产物。花生壳重量占花生总重的30%左右，其中不仅含有丰富的木质素和纤维素，少量淀粉、蛋白质等成分，还含有木犀草素、5,7-二羟基色原酮、圣草酚等多种黄酮类物质[1-2]。

黄酮类物质广泛存在于植物的根、茎、叶、花及果实中，且种类多，结构复杂，以C6-C3-C6为基本骨架见图1，是在A、B、C环上连接不同的取代基而形成的一组化合物。黄酮类物质具有抑菌、消炎、清除自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、增强免疫力等生物活性，是中草药的重要成分[3-7]。从植物中提取出的黄酮类物质具有明显的抗氧化性及抑菌性，可以将其应用于肉制品及乳制品的保鲜[8-9]。黄酮类物质除作为食品保鲜剂外，还可以将其用来开发调味品[10-11]。

图1 黄酮类物质的C6-C3-C6骨架结构

目前，花生壳并没有得到很好的开发利用，绝大部分花生壳被焚烧或丢弃，只有少部分被制成饲料，造成了花生壳资源的大量浪费，而且会危害环境。本研究以花生壳为原料，利用纤维素酶来辅助提取其中的黄酮类物质，并进行抗氧化及抑菌试验，以期为其在食品、医药、化工等领域的应用提供理论依据。对农产品加工副产物进行综合利用不但是对农产品废弃物高效转化的一种体现，还可以获得良好的经济效益及社会效益，对我国相关产业的发展也具有深远影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生：购于河南安阳某市场，手工剥壳；芦丁标准品：上海哈灵生物科技有限公司；纤维素酶(10 U/mg)：深圳绿微康生物科技有限公司；2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基(DPPH)：上海麦克林生化科技有限公司；抗坏血酸(Vc)：国药集团化学试剂有限公司；AB-8大孔树脂：北京索莱宝科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌：由安阳工学院生物与食品工程学院微生物实验室提供；其他化学试剂：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FW-400A粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；TD02D电子分析天平 余姚市金诺天平仪器有限公司；201D旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司；T9紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HH8台式低速大容量离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；L550数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；HL-2F恒流泵 上海嘉鹏科技有限公司； STELLAR 85真空冷冻干燥机 美国Millrock公司；SW-CJ-2D超净工作台 苏州净化设备有限公司；TM-XD50D台式快速蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司；GHP-9160隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 提取方法

筛选出外观完好的花生壳，洗净，干燥，粉碎，过60目筛，备用。向250 mL具塞三角瓶中加入5 g花生壳粉、一定量的纤维素酶、体积分数70%的乙醇水溶液，置于恒温水浴中进行酶解提取，冷却至室温后进行过滤。收集滤液，经离心机转速4000 r/min离心10 min，收集上清液，测定黄酮的提取率。

1.4 提取率的计算

以芦丁标准品来绘制标准曲线[12]，得线性回归方程为：y=3.5022x+0.0055(R2=0.9967)。

将提取到的上清液置于100 mL的容量瓶中，用70%乙醇定容，取5 mL于25 mL的容量瓶中，按标准曲线的方法测定花生壳黄酮的提取率，公式如下：

式中：R为花生壳黄酮的提取率，%；m为花生壳质量，g；c为测得黄酮浓度，mg/mL；v为样品溶液体积，mL；n为溶液稀释倍数。

1.5 单因素及正交试验

以黄酮提取率为响应值，分别选择酶添加量(0.4%～1.4%，占花生壳的质量)、酶解时间(60～180 min)、酶解温度(35～65 ℃)、料液比(1∶4～1∶14，g/mL)进行单因素试验，以单因素试验结果来设计四因素三水平正交试验，优化黄酮提取工艺，以获得最佳工艺参数。

1.6 大孔树脂纯化

AB-8大孔树脂用无水乙醇浸泡24 h后，用蒸馏水冲洗至无乙醇味，加入层析柱中。花生壳黄酮提取液经旋转蒸发仪40 ℃，200 r/min进行减压浓缩，浓缩液加蒸馏水稀释至2 mg/mL，设置恒流泵转速45 r/min，流速1.42 mL/min，上样量2.5倍树脂体积；5倍树脂体积蒸馏水进行洗涤后，4倍树脂体积70%乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液减压蒸馏，得到浓缩液备用。

将1.3和1.6得到的浓缩液置于真空冷冻干燥机内，冷冻条件：-40 ℃、10 h，-60 ℃、26 h；干燥条件：10 ℃、28 h，20 ℃、20 h，真空度100 mt，分别得到花生壳黄酮粗提物、纯化后花生壳黄酮。

1.7 抗氧化试验

取纯化后的花生壳黄酮，用70%乙醇配制成5 mg/mL的样品溶液，再梯度稀释成不同浓度的花生壳黄酮溶液(1，2，3，4，5 mg/mL)，测定其对羟基自由基和DPPH自由基的清除作用，以70%乙醇作阴性对照，相同浓度的Vc溶液作阳性对照。

1.8 抑菌试验

1.8.1 抑菌试验

采用滤纸片法对花生壳黄酮的抑菌性进行测定[13]。配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌，备用；在超净工作台上，采用划线法将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌接种至斜面培养基上，置于37 ℃培养箱中培养24 h，备用；分别用无菌水对斜面培养基上的4种细菌进行稀释，得到菌体浓度为106个/mL的菌悬液，备用；取纯化后的花生壳黄酮，用无菌水配制成浓度为0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL的样品溶液，取直径为6 mm的圆形滤纸片，高压灭菌后放入不同浓度样品溶液中浸泡1 h，备用；分别向平板培养基上加入0.5 mL的菌悬液，并涂布均匀，将浸湿的滤纸片贴在平板表面，置于恒温培养箱中37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径，重复3次取平均值，以生理盐水作为阴性对照。

1.8.2 最小抑菌浓度(MIC)试验

取纯化后的花生壳黄酮，用无菌水溶解后，加入无菌培养基中，使其在培养基中的浓度分别为0.50，0.75，1.00，1.25 mg/mL，倒入培养皿，凝固后，分别加入金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌各100 μL，涂布均匀，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，肉眼观察是否有可见菌。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶添加量对提取率的影响

固定料液比1∶8、酶解时间150 min、酶解温度50 ℃，考察酶添加量对黄酮提取率的影响，结果见图2。

图2 酶添加量对提取率的影响

由图2可知，随着酶添加量的增大，黄酮提取率也逐渐增大，在酶添加量达到1.0%时，提取率为2.378%，此后再增大酶添加量，提取率并没有明显提高。花生壳作为底物，浓度是固定的，当增加纤维素酶的用量时，酶的浓度被提高，加速了酶与底物的反应速度，促进了细胞破裂，从而使黄酮类物质溶出，提取率提高；当酶的浓度达到饱和时，反应速度达到平衡，再增加酶的用量也不会明显地提高提取率。

2.1.2 酶解时间对提取率的影响

固定酶添加量1.0%、料液比1∶8、酶解温度50 ℃，考察酶解时间对黄酮提取率的影响，结果见图3。

图3 酶解时间对提取率的影响

由图3可知，随着酶解时间的延长，花生壳黄酮提取率明显提高，当酶解时间为90 min时，提取率为2.403%，此后再延长酶解时间，提取率反而有所下降。在反应初期，延长酶解时间可以使酶与底物之间的反应充分进行，提高黄酮提取率；在反应完成以后，酶逐渐失去活性，长时间的作用也可能导致黄酮结构被破坏，降低了提取率。

2.1.3 酶解温度对提取率的影响

固定酶添加量1.0%、料液比1∶8、酶解时间90 min，考察酶解温度对黄酮提取率的影响，结果见图4。

图4 酶解温度对提取率的影响

由图4可知，随着酶解温度的升高，黄酮提取率变化明显，在35～45 ℃时，提取率随着温度的升高而增大，在45 ℃时达到最大，为2.495%。当温度超过45 ℃后，随着温度的持续增大，黄酮提取率却开始下降。酶活性受温度的影响较大，酶可以在短时间内耐受较高的温度，而当反应时间较长时，最适温度会向温度降低的方向移动。在实际应用中，应根据酶促反应作用时间的长短，选定不同的最适温度。

2.1.4 料液比对提取率的影响

固定酶添加量1.0%、酶解时间90 min、酶解温度45 ℃，考察料液比对黄酮提取率的影响，结果见图5。

图5 料液比对提取率的影响

由图5可知，随着料液比的改变，黄酮提取率发生变化明显，在料液比为1∶4～1∶8时，黄酮提取率随提取液的增加而提高，当料液比为1∶10时，提取率达到最大值2.576%，之后再增加提取液提取率反而下降。提取液的添加量会直接影响到酶和底物的浓度，提取液过少时，酶和底物接触不充分，提取液过多又会稀释酶和底物的浓度，只有当酶和底物的浓度达到理想值时，反应才能充分进行。

2.2 正交试验

酶解法提取花生壳黄酮的正交试验设计和结果见表1和表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交组合及试验结果

由表2可知，RC>RA>RD>RB，即4个因素对提取率的影响主次顺序依次为酶解温度>酶添加量>料液比>酶解时间。各因素最优组合为A2B3C2D2，经验证最佳工艺条件是：酶添加量1.0%、酶解时间120 min、酶解温度45 ℃、料液比1∶10，在此条件下进行花生壳黄酮的提取试验，最终提取率可达到2.593%。

2.3 大孔树脂纯化

对正交试验得到的最佳工艺进行提取，对比纯化前后提取物中黄酮的含量，发现花生壳黄酮提取物经AB-8大孔树脂纯化后，其黄酮含量由12.71%提高到25.32%。

2.4 抗氧化性试验

2.4.1 对羟基自由基的清除作用

花生壳黄酮对羟基自由基的清除作用见图6。

图6 黄酮对羟基自由基的清除率

由图6可知，随着黄酮浓度的增加，花生壳黄酮对羟基自由基的清除效果增强，在相同浓度下，黄酮对羟基自由基的清除能力均高于Vc；在浓度为5 mg/mL时，对羟基自由基的清除率为84.5%。

2.4.2 对DPPH自由基的清除能力

花生壳黄酮对DPPH自由基的清除能力见图7。

图7 黄酮对DPPH自由基的清除率

2.5 抑菌性试验

花生壳黄酮的抑菌作用见表3，最小抑菌浓度见表4。

表3 花生壳黄酮的抑菌作用Table 3 The antibacterial effect of flavonoids from peanut shells

表4 花生壳黄酮最小抑菌浓度(MIC)

由表3和表4可知，随着花生壳黄酮浓度的增大，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用明显增强，浓度为1.25 mg/mL时对这4种细菌均有明显的抑制作用，花生壳黄酮对4种细菌的MIC分别为金黄色葡萄球菌1.00 mg/mL、大肠杆菌1.25 mg/mL、沙门氏菌0.75 mg/mL、枯草芽孢杆菌1.00 mg/mL。

3 结论

黄酮类物质多存在于植物细胞中，纤维素是构成细胞壁的主要成分，通过添加纤维素酶可以破坏细胞壁结构，加速细胞内物质的溶出速度。本试验在单因素试验的基础上，进行酶添加量、酶解时间、酶解温度、料液比四因素三水平的正交试验，得到花生壳黄酮最佳提取工艺为：酶添加量1.0%、酶解时间120 min、酶解温度45 ℃、料液比1∶10，在此条件下花生壳黄酮的提取率可达到2.593%。

机体内存在大量自由基会加速衰老和疾病的产生，黄酮类物质所含的酚羟基可以与自由基结合，终止氧化链式反应，起到抗氧化的作用。本试验通过对羟基自由基和DPPH自由基的清除效果来测定花生壳黄酮的抗氧化性，结果表明花生壳黄酮对羟基自由基和DPPH自由基的清除率与其浓度呈正相关；在相同浓度下，其清除能力均高于Vc。

黄酮类物质的抑菌性与其骨架结构上连接的羟基位置和数量有关，抑菌机理主要包括破坏菌体细胞结构、抑制菌体内酶的活性、抑制菌体内物质及能力的代谢等作用。抑菌性试验表明花生壳黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌都有较好的抑制作用，且抑菌效果与其浓度呈正相关；最小抑菌浓度试验表明在浓度达到1.25 mg/mL时，对以上4种细菌即可表现出明显的抑制作用。

我们可以利用花生壳黄酮的抗氧化性和抑菌性，将其应用于食品、化妆品、医药等领域。目前，国内外关于黄酮类物质作为食品保鲜剂的报道比较多，但将其应用于调味品的研究还比较少见。近年来，人们对调味品的要求不仅仅是要满足味蕾的需求，还要求其更加营养、安全、健康，因此，营养调味品、功能调味品等复合调味品具有广阔的市场前景[14]。黄酮类物质作为天然功能性成分虽然健康、安全、无副作用，但其稳定性不如化学合成物质，因此，可以利用微胶囊等技术来减少其营养成分的损失，延长货架期，扩大其在调味品中的应用范围[15]。