冷榨法提取南瓜籽蛋白质的工艺研究

张雪，唐建华

(1.吉林工程职业学院，吉林 四平 136001；2.扬州大学 旅游烹饪学院，江苏 扬州 225127)

1 概述

南瓜营养价值较高，是一种既营养又美味的家常蔬菜[1]。而南瓜籽含有的丰富蛋白质、维生素，使其医药功效加倍，具有实际研究价值[2]。在南瓜研发热潮中，蛋白质是南瓜研发的一个重要热点[3]。南瓜籽蛋白质含量约为35%，人体吸收率在88%～97%之间，具有良好的平衡能力。南瓜籽富含蛋白质、脂肪、矿物质，营养丰富，也是优良的植物蛋白[4]。有学者研究发现，南瓜籽发芽后，蛋白质更具降血糖效果[5]。

以往使用三氯醋酸-丙酮沉淀法提取南瓜籽蛋白质，低温下将南瓜籽充分研磨后，加入三氯醋酸和丙酮共溶于离心管内，涡旋振荡，在20 ℃静置2 h，离心反复洗涤，沉淀至无色，并进行真空冷冻干燥。该方法容易破坏蛋白质，导致提取结果杂质较多；使用电泳法提取南瓜籽蛋白质，借助多种蛋白酶水解南瓜籽蛋白，并筛选出适用于制备南瓜籽蛋白的抑制肽蛋白酶，结合响应面方法优化提取工艺。使用该方法在电场环境中，容易受到背景颜色的影响，使蛋白质无法全部提取，导致蛋白质提取效率低下。因此，在提取南瓜籽蛋白质时，首先要考虑到蛋白质资源的利用，采用冷榨法可以很好地保存南瓜籽的营养成分，以南瓜籽作为原料，采用冷榨法提取蛋白质，并对蛋白质的功能特性进行分析，为其有效利用提供参考。

2 材料与方法

2.1 主要材料与试剂

南瓜籽仁：广州雪馨花食品有限公司的白瓜籽；正己烷：淄博协创化工有限公司；冰乙酸：济南金百禾工贸有限公司；乙醇：山东汇丰生物工程有限公司；丙酮：宁波印川国际贸易有限公司；碘化钾：上海氏典化工科技发展有限公司；硫代硫酸钠：武汉拉那白医药化工有限公司；乙酸钠：郑州润稼化工产品有限公司，上述试剂均为分析纯。

2.2 仪器与设备

GY95-冷榨机 广州国研机械设备制造有限公司；Alpha Imager HP蛋白凝胶成像系统 上海巴玖实业有限公司；M249300超低温冰箱 北京海富达科技有限公司；LGJ-10-50系列冷冻干燥机 南京贝帝实验仪器有限公司；DR3900紫外分光光度计 上海植茂环保科技有限公司。

2.3 试验方法

2.3.1 南瓜籽蛋白质特点分析

2.3.1.1 蛋白质持水性和持油性

蛋白质的持水性和持油性是南瓜籽蛋白质中重要功能特性之一，当温度和加热时间增加时，蛋白质出现的反应见图1。

图1 蛋白质持水性和持油性分析Fig.1 Analysis of water and oil holding capacity of proteins

由图1可知，南瓜籽蛋白质综合持油能力比持水能力强，且随着温度升高，蛋白质的持油能力在100 ℃时达到最高。蛋白质的持水能力在60 ℃时达到最高，出现这种情况的主要原因是温度升高，使蛋白质变性，产生大量极性侧链基团，增强了蛋白质的亲水性和亲油性。

2.3.1.2 蛋白质溶解性

蛋白质与水之间的作用力是由蛋白中肽键的偶极-偶极作用而产生的，或离子化的、极性侧链的同分子作用而产生的，蛋白质的溶解性受到pH值的影响较大，其溶解性见图2。

图2 蛋白质溶解性Fig.2 The solubility of protein

由图2可知，当pH值为4.5时，蛋白质的溶解性最差，该值为蛋白质溶解度最低值，因此，可将该点作为提取蛋白质时酸性沉淀的pH值[6]。

pH值对蛋白质提取率的影响见表1。

表1 pH值对蛋白质提取率的影响Table 1 The effect of pH value on the extraction rate of protein

随着pH值不断升高，蛋白质的提取率也在不断增大(P<0.01)[7]。为了确定最佳pH值，不同pH值下提取蛋白质的各个参数试验条件见表2。

表2 蛋白质各个参数试验条件Table 2 The test conditions for each parameter of protein

由表3可知，随着pH值升高，蛋白质的提取效率也在不断升高[8]。当pH值为10时，变性蛋白的需求量最大，而提取蛋白的含水量最大，故 pH值以10为最佳[9-10]。

表3 测定结果Table 3 The determination results

2.3.1.3 其他特性

对于南瓜籽蛋白质的其他特性进行研究，以大豆蛋白质为基础，对比结果见表4。

表4 蛋白质其他特性

由表4可知，南瓜籽蛋白质比大豆蛋白质的吸水性、吸油性低，而其他特性比大豆蛋白质要高。

2.3.2 工艺流程

南瓜籽→温度低于60 ℃→调制→冷榨→冷榨蛋白质→精滤→冷榨南瓜籽蛋白质。

2.3.3 蛋白质提取效率计算

(1)

式中：m1表示提取的蛋白质质量；m表示南瓜籽中蛋白质质量。

2.4 指标测定

2.4.1 冷榨温度对工艺的影响

在用冷榨法提取南瓜籽蛋白时，适当的高温有利于保持蛋白质的可塑性，有利于破坏解脂酶、脂肪氧化酶，也便于蛋白质提取后进行储存和使用。但在高温环境下，冷榨工艺也会产生一些副作用，如在冷榨过程中水分大量增加，破坏蛋白质的可塑性，在提高蛋白质杂质含量的同时，其他杂质也在增加，因此，研究的冷榨温度范围应选择45～60 ℃。

工艺反应条件：选择的冷榨温度分别为45，50，55，60 ℃，研究冷榨温度对南瓜籽蛋白质提取效率的影响，见表5。

表5 冷榨温度对工艺的影响Table 5 The effect of cold pressing temperature on process

由表5可知，随着冷榨温度的升高，蛋白质的提取效率也不断提高，但冷榨温度的标准要求低于60 ℃时，若温度过高，会严重损害南瓜籽的营养成分，故选用60 ℃为宜。

2.4.2 冷榨水分含量对工艺的影响

随着冷榨水分含量不断增加，蛋白质的可塑性也在不断发生变化。当冷榨水分含量达到某一阈值时，南瓜籽蛋白质的提取效果达到最佳，此时的水分含量即为临界水分。临界水分与温度、蛋白质变性程度有关，在冷榨过程中，主要影响蛋白质提取纯度的是含水量，当水分含量过低时，冷榨温度升高，此时蛋白质变性，影响工艺效果；当水分含量过高时，破坏南瓜籽，无法形成蛋白质，南瓜籽蛋白质的提取效率低，同样也影响工艺效果。

工艺反应条件：通过表5确定的最佳冷榨控制温度为60 ℃，在该温度下，选取水分含量分别为5%、10%、15%、20%进行冷榨，由此研究冷榨水分含量对南瓜籽蛋白质提取效率的影响，结果见表6。

表6 冷榨水分含量对工艺的影响Table 6 The effect of cold pressing water content on process

由表6可知，随着水分含量增加，南瓜籽蛋白质的提取效率呈先升高后下降的趋势，当水分含量为10%时，南瓜籽蛋白质的提取效率达到最高，而当水分含量为15%时，南瓜籽蛋白质的提取效率下降，说明水分含量过多不利于南瓜籽蛋白质的提取。

2.4.3 冷榨压力对工艺的影响

南瓜籽在冷榨过程中的压榨，主要是由于南瓜籽受压后固体内外表面受到挤压，蛋白质被榨出造成的。在相同情况下，蛋白质受到的压榨程度越大，粒子塑性变形程度越大，提取出的蛋白质成分也就越多。然而，受到某种压力的影响，冷榨压缩存在一定限度，即使压力增加到最大值，压缩能力也不再增加，此时为不可压缩体，也就是极限压力。

工艺反应条件：通过表5确定的最佳冷榨控制温度为60 ℃，通过表6确定的最佳水分含量为15%，在该温度和水分含量下，选取冷榨压力分别为1.0，2.0，3.0，4.0 MPa进行冷榨，由此研究冷榨压力对南瓜籽蛋白质提取效率的影响，结果见表7。

表7 冷榨压力对工艺的影响Table 7 The effect of cold pressing pressure on process

由表7可知，随着冷榨压力增加，南瓜籽蛋白质的提取效率升高，但变化幅度不大。为了防止在蛋白质提取过程中压力过大影响提取效率，选择压力为3.0 MPa作为工艺提取指标。

2.4.4 冷榨转速对工艺的影响

工艺反应条件：通过表5确定的最佳冷榨控制温度为60 ℃，通过表6确定的最佳水分含量为15%，通过表7确定的冷榨压力为3.0 MPa，在该温度、水分含量和压力下，选取冷榨转速分别为32，34，36，38，40，42，44 r/min进行冷榨，由此研究冷榨转速对南瓜籽蛋白质提取效率的影响，结果见表8。

表8 冷榨转速对工艺影响Table 8 The effect of cold pressing rotating speed on process

由表8可知，转速越大，南瓜籽蛋白质的提取效率也随之变大，其中当转速为42 r/min时，南瓜籽蛋白质的提取效率达到最高为66.7%，然而，当转速为44 r/min时，南瓜籽蛋白质的提取效率却降低。因此，选择42 r/min作为蛋白质提取工艺的最佳转速。

通过上述分析可知，影响南瓜籽蛋白质提取的因素主要为冷榨温度、冷榨水分含量、冷榨压力和冷榨转速，其中当温度为60 ℃、水分含量为15%、冷榨压力为3.0 MPa、冷榨转速为42 r/min时，南瓜籽蛋白质的提取效果最好。为了验证该情况下提取效果良好，需使用不同提取方法与冷榨法对比，并在紫外分光光度计支持下完成对比分析。

3 结果与讨论

将南瓜籽分成3组，每组150 g南瓜籽，使用紫外分光光度计测定蛋白质的纯度。选择5个10 mL比色管，用0.9% NaCl溶液溶解，将蛋白质稀释成250 mL，3个试管大小为1.5 cm×15 cm×9 cm。分别使用三氯醋酸-丙酮沉淀法、电泳法和冷榨法提取南瓜籽蛋白质，以下为对比内容及结果。

3.1 基本原理

使用紫外分光光度计检测蛋白质提取效率时，由于蛋白质中含有共轭双键，使蛋白质具有很强的吸收紫外光特性。在一定波长下，分析蛋白质溶液吸光度值与蛋白质溶液浓度的关系，由此获取蛋白质提取效果。

3.2 试验步骤

选取光程为1 cm、波长为290 nm、纵坐标为A290、横坐标为蛋白质浓度的石英比色皿，将1 mL待测蛋白质溶液配以1 mL，加入3 mL蒸馏水，摇动均匀，测定A290。

3.3 测定结果与分析

分别使用三氯醋酸-丙酮沉淀法、电泳法和冷榨法提取蛋白质，其紫外分光光度计测定结果见图3。

(a)三氯醋酸-丙酮沉淀法

(b)电泳法

(c)冷榨法

3.3.1 三氯醋酸-丙酮沉淀法

使用三氯醋酸-丙酮沉淀法处理南瓜籽时较难，得到的蛋白质浓度不高。当蒸馏水为3.0 mL时，随着蛋白质浓度增加，吸收紫外光波长也随之增加，当蛋白质浓度为2.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为235 nm；在蒸馏水为1.5 mL情况下，当蛋白质浓度为2.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为255 nm；在蒸馏水为0 mL情况下，当蛋白质浓度为2.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为260 nm。

3.3.2 电泳法

使用电泳法虽然提取杂质少，但在提取过程中会影响蛋白质迁移速率。当蒸馏水为3.0 mL时，随着蛋白质浓度增加，吸收紫外光波长也随之增加，当蛋白质浓度为3.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为240 nm；在蒸馏水为1.5 mL情况下，当蛋白质浓度为3.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为255 nm；在蒸馏水为0 mL情况下，当蛋白质浓度为3.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为270 nm。

3.3.3 冷榨法

使用冷榨法不会破坏南瓜籽的组织结构，当蒸馏水为3.0 mL时，随着蛋白质浓度增加，吸收紫外光波长也随之增加，当蛋白质浓度为3.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为240 nm；在蒸馏水为1.5 mL情况下，当蛋白质浓度为3.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为265 nm；在蒸馏水为0 mL情况下，当蛋白质浓度为3.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为290 nm。

通过上述分析结果可知，使用冷榨法能够提取高纯度蛋白质。

4 结论

通过研究确定：

(1)南瓜籽蛋白质的持水能力比持油能力强，蛋白质在pH值为4.5时，溶解度达到最低；

(2)南瓜籽蛋白质比大豆蛋白质的吸水性、吸油性低，而其他特性比大豆蛋白质要高；

(3)冷榨控制最佳温度为60 ℃，最佳水分含量为15%，最佳冷榨压力为3.0 MPa，最佳转速为42 r/min。

通过试验验证可知，使用冷榨法不会破坏南瓜籽的组织结构，在蒸馏水为0 mL情况下，蛋白质浓度为3.5 mL时，吸收紫外光波长达到最高，为290 nm，能够提取高纯度蛋白质。