MiR-520f-3p靶向SOX9抑制结肠癌的恶性进展

许鸣超，侯鹏飞，张令巧

(濮阳市油田总医院消化内科，河南 濮阳 457001)

结肠癌是世界上第4大常见的癌症，也是癌症死亡的第3大原因[1]。尽管随着结肠镜的发展和普及，结肠癌的发病率和死亡率有所下降[2]。但是，每年结肠癌的死亡率和死亡人数仍然很高。因此，探究结肠癌发生、发展的分子机制，制定结肠癌的治疗策略具有重要意义。

有研究表明miRNA可能作为癌基因或抑癌基因来调节增殖、迁移和侵袭过程中关键调控因子的表达进而影响结肠癌的发生、发展[3]。miR-4711-5p通过KLF5、MDM2和TFDP1调控结肠癌细胞的干细胞特性和细胞周期[4]。miR-520f-3p作为miRNA的一种，在多种癌症中异常表达。例如，胆管癌[5]、胶质母细胞瘤[6]和胃癌[7]等。但是miR-520f-3p影响结肠癌的作用机制仍不完善，需要进一步探索。

转录因子SOX9(SRY-related high mobility group-box 9)属于SOX蛋白家族，包括SOX8、SOX9、SOX10和SOXE[8]。许多研究表明SOX9对多种癌症的发生发展都有影响，例如SOX9通过Wnt/β-catenin信号通路影响非小细胞肺癌的上皮-间充质转化[9]；miR-30c通过靶向SOX9阻碍胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移[10]。但是，关于SOX9在结肠癌细胞中的功能鲜有研究。

本次实验主要研究了miR-520f-3p和SOX9在结肠癌细胞表达情况以及miR-520f-3p与SOX9基因对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的调控作用机制，为结肠癌的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞及仪器

人正常结肠上皮细胞系NCM-460(BNCC339288)和人结肠癌细胞系HCT 116(BNCC337692)、SW480(BNCC100604)、HT-29(BNCC100164)均购自北纳生物。

FBS(Gibco，Grand Island，NY，USA)、Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)、反转录试剂盒Revert Aid First Strand(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Vilnius，Lithuania)、QuantiTect SYBR Green PCR Master mix(Takara Bio，Inc.，Otsu，Japan)、BCA定量试剂盒(Thermo fisher，USA)、PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)、ECL试剂盒(Solarbio，Beijing，China)、兔抗SOX9(Abcam，UK)、兔抗β-actin(Abcam，UK)，山羊抗兔IgG(Abcam，UK)、CCK8溶液(Dojidon，Japan)、酶标仪(Bio-Rad，USA)、Transwell(BD Biosciences，CA，USA)、pmirGLO荧光素酶报告载体(Promega，WI，USA)、基因检测试剂盒(Promega，Fitchburg，WI，USA)、GraphPad Prism软件(GraphPad，USA)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

NCM-460和HT-29在McCoy’s 5A培养基中培养，HCT 116在RPMI-1640培养基中培养，SW480在DMEM高糖培养基中培养。培养基均添加10%的FBS。所有细胞都在CO2浓度为5%、温度为37℃的培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染

miR-520f-3p模拟物miR-520f-3p mimics和对照模拟物NC mimics以及pcDNA3.1-SOX9载体oe-SOX9和空的pcDNA3.1质粒载体oe-NC均由GenePharma公司(中国上海)合成。根据制造商说明书使用Lipofectamine 2000转染。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测(qRT-PCR)

谢清森通过主动申请联系和多方努力，在2014年与英国联合安保公司成功牵手，共同成立七兵堂国际安保集团(中国)有限公司，这一跨越国界和意识形态的欧亚牵手，标志着七兵堂正式开始涉足国际安保服务领域，历史性地实现了走出国门、迈向世界的远大梦想。

采用TRIzol试剂从细胞提取总RNA。使用反转录试剂盒Revert Aid First Strand将RNA逆转录成cDNA，采用QuantiTect SYBR Green PCR Master mix进行qRT-PCR实验。SOX9以GAPDH为内参，miR-520f-3p以U6为内参，引物序列如下：miR-520f-3p(forward)：5'-GTGCCTGTTGCGTCTC-3'，(reverse)：5'-GAAAGCCTAGCCGTATTCG-3'；SOX9(forward)：5'-AGGAAGTCGGTGAAGAACGG-3'，(reverse)：5'-CGCCTTGAAGATGGCGTTG-3'；GAPDH(forward)：5'-TGACTTCAA CAGCGACACCCA-3'，(reverse)：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；U6(forward)：5'-GACCGAGTGTAGCAAGG-3'；(reverse)：5'-GTTCTTCCGAGAACATATAC-3'。结果用2-ΔΔCt值来比较对照组和实验组miR-520f-3p和SOX9 mRNA相对表达量的差异。

1.2.4 Western blot实验

使用全蛋白裂解液裂解细胞，BCA定量试剂盒检测样品蛋白浓度。取样品进行10% SDS-PAGE电泳。然后将蛋白样品转移到PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶封闭2h。用一抗孵育一晚，二抗孵育1h。最后，用ECL试剂盒检测蛋白印记并拍照。本研究所用的一抗为：兔抗SOX9、兔抗β-actin，二抗为：山羊抗兔IgG。

1.2.5 细胞增殖实验

采用CCK8比色法检测细胞增殖能力。将细胞以每孔5×103个细胞/孔的浓度接种于96孔平板。分别培养24h、48h和72h后，每组选取5个复孔，在孔中加入10μL CCK8溶液孵育1h。最后使用酶标仪检测细胞在450nm波长下的吸光度。

1.2.6 细胞划痕实验

将细胞接种于12孔板(2×105个/孔)中，当细胞融合度达到90%时，采用200μL无菌枪头人为的轻轻划擦穿过孔中心的单层。然后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞2次，并在无血清培养基中孵育。分别再培养24h后用显微镜观察并拍摄愈合图像。

1.2.7 细胞侵袭实验

在涂有基质胶的Transwell上室中接种约2×104个细胞，在下室中加入600μL含有10% FBS的DMEM培养基。培养48h后用4%甲醛溶液进行固定，用0.1%的结晶紫染色。选取5个视野，通过显微镜观察细胞的侵袭情况并拍照。

1.2.8 双荧光素酶实验

构建了插入SOX9野生型(wt)和突变型(mut)3' UTR的pmirGLO荧光素酶报告载体。将HCT 116细胞接种在48孔板中并培养24h，将miR-520f-3p mimics/NC-mimics和pmirGLO wt/mut质粒共转染到细胞中，48h后收集细胞。然后，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 miR-520f-3p在结肠癌细胞中低表达

qRT-PCR实验结果显示，与正常结肠上皮细胞系NCM-460相比，结肠癌细胞系HCT 116、SW 480、HT-29中miR-520f-3p表达显著下调(图1)。

(与NCM-460相比，*P<0.05，n=3)

2.2 过表达miR-520f-3p抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

qRT-PCR实验结果显示，过表达组的miR-520f-3p表达量显著高于对照组(图2A，封三)，可以用于接下来的实验。随后，CCK8实验发现过表达miR-520f-3p的结肠癌细胞相较于对照组增殖能力明显降低(图2B，封三)。细胞划痕实验结果显示，在HCT 116细胞中，过表达miR-520f-3p显著抑制了细胞的迁移(图2C，封三)。Transwell实验结果显示转染miR-520f-3p mimic的HCT 116细胞侵袭能力低于对照组(图2D，封三)。这些结果表明，过表达miR-520f-3p可以抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

2.3 miR-520f-3p靶向下调SOX9

qRT-PCR和Western blot检测人正常结肠上皮细胞系和人结肠癌细胞系中SOX9 mRNA和蛋白的表达，结果显示SOX9 mRNA和蛋白在结肠癌细胞系中表达上调(图3A～3B)。Targetscan预测得到SOX9和miR-520f-3p之间存在靶向结合位点(图3C)。双荧光素酶实验进行验证，结果发现miR-141-3p过表达会显著降低SOX9-wt荧光素酶活性，而对SOX9-mut荧光酶素活性无明显影响(图3D)。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，过表达miR-520f-3p后，SOX9的表达水平显著下调(图3E～3F)。这些实验结果证明了miR-520f-3p在结肠癌细胞中靶向调控SOX9。

2.4 miR-520f-3p靶向下调SOX9抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

qRT-PCR和Western blot检测结果显示过表达处理SOX9后，SOX9 mRNA和蛋白表达水平均显著上调；而同时过表达miR-520f-3p后，SOX9的表达水平明显下降(图3A～B，封三)。CCK8、细胞划痕实验和Transwell实验，结果表明当SOX9表达上调时，结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强，然而，同时过表达miR-520f-3p后细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低(图4C～E，封三)。这些实验结果证明了miR-520f-3p是通过调控SOX9抑制了结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

3 讨 论

结肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因[1]。尽管治疗手段不断发展，结肠癌的五年生存率仍不令人满意[2]。因此，十分有必要探究结肠癌发生发展的机制，寻找更好的治疗方法。在过去的研究中，miRNA被发现在许多类型的人类癌症中调控癌细胞的生物学功能，这可以作为治疗靶标[11]。对于结肠癌，人们发现miR-378通过抑制SDAD1抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12]；miR-219a-1通过靶向MEMO1抑制结肠癌细胞增殖和侵袭[13]，可见miRNA是结肠癌潜在生物标志物的来源之一。目前为止，miR-520f已被发现在NSCLC中发挥肿瘤抑制因子的作用，circ-0043278通过直接抑制miR-520f来增加ROCK1、CDKN1B和AKT3的表达，从而促进NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移[14]；另外，miR-520f被发现在人HCC组织和细胞系中显著下调。而且，miR-520f的表达异常与HCC患者的较大肿瘤、晚期TNM分期和转移密切相关。但是，miR-520f-3p在结肠癌细胞系中的表达模式和作用仍然未知。在本次研究中发现，相比于人正常结肠上皮细胞，miR-520f-3p在结肠癌细胞系中均显著低表达，这与其在其它疾病中的结果一致。

在本研究中，通过构建过表达miR-520f-3p的结肠癌细胞，以及细胞功能实验，发现过表达miR-520f-3p可以抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这些实验结果表明，miR-520f-3p是结肠癌进展中的肿瘤抑制因子。与本研究结果一致，先前的研究发现miR-520f抑制肝癌细胞的增殖和侵袭[15]，下调miR-520f的表达水平会导致胃癌细胞增殖能力增强[16]。

已知miRNA通过靶mRNA3'-UTR结合来控制基因表达。为了评估miR-520f-3p如何影响结肠癌，本研究在结肠癌细胞系中鉴定其靶基因。以往有研究表明，miR-520f-3p在SOX9在结肠癌的进展中发挥了关键作用[17]。SOX9是一种特殊的转录因子，它在调节软骨形成、性腺和胰腺形成等多种发育途径中发挥重要作用[18]。多种miRNA已显示靶向SOX9，据报道，miRNA-105通过直接靶向SOX9抑制胃癌的进展[19]；Sang等研究报道miR-613在胶质瘤细胞中靶向SOX9抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[20]。本研究发现SOX9在结肠癌细胞系中表达上调，在结肠癌细胞中miR-520f-3p能够调控SOX9的表达水平，并且双荧光素酶实验证实了两者之间的靶向关系。进一步的研究发现，过表达miR-520f-3p能够回复上调SOX9对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭过程的促进作用。这些结果表明，miR-520f-3p通过调控SOX9进而抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，调节miR-520f-3p/SOX9途径的靶向疗法可能会成为改善结肠癌患者生存率的新机会。

总而言之，本研究证明了在结肠癌中miR-520f-3p低表达，发挥抑癌作用，上调miR-520f-3p能够抑制SOX9的表达进而抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学功能；同时也揭示了miR-520f-3p在结肠癌恶性进程中的调控机制。这些发现为miR-520f-3p作为结肠癌的靶向化疗药物提供了实验基础，为靶向治疗结肠癌提供新思路，从而促进新型抗癌药物的开发。