沉默C/EBP β抑制肺腺癌A549的恶性生物学行为

王健键，康 凯，易胜中

(湖北省肿瘤医院胸外科，湖北 武汉 430071)

CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBP β)是CCAAT/增强子结合蛋白家族中非常重要转录因子，具有普遍生物学功能，可以调节细胞增殖、分化，并参与侵袭、增殖和凋亡等细胞分子生命活动，进而影响肿瘤的发生、发展进程[1]。

肺癌已成为发病率和死亡率居首位的癌症，而肺腺癌(lung adenocarcinoma cancer，LAC)是非小细胞肺癌中最常见的病理类型[2]，具有早期症状不典型、发病隐匿、进展迅速的特点，大多数确诊时都为晚期，导致此病的预后、生存率偏低。从分子水平研究肺腺癌的发病机制具有重要意义，随着医学的进步，从分子水平介入，又能为提高肺腺癌诊疗提供很好的思路[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

肺腺癌A549细胞株自购于中国科学院(上海)细胞库。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基购自Hyclone公司。转染试剂lipofectamine2000购自Invitrogen公司。Transwell小室购于美国Corning公司。Matrigel基质胶为BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将肺腺癌A549细胞株放置在37℃，体积分数为5%CO2的细胞培养箱中常规培养。培养液选用含10%FBS和100×双抗的DMEM高糖培养基。

1.2.2 细胞转染与分组

当肺腺癌A549细胞汇合度达到50%左右时，开始进行siRNA转染。将C/EBP β siRNA、siRNA control按lipofectamine 2000转染试剂说明书操作。转染后收集细胞用于后续实验。Western blot检测C/EBP β的沉默效率。转染C/EBP β siRNA的肺腺癌A549细胞记为C/EBP β-siRNA组，转染siRNA control后的肺腺癌A549细胞记control-siRNA组[4-5]。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖活性

收集对数生长期的C/EBP β siRNA干扰细胞、siRNA control细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL后，接种在96孔板中，每组设置6个复孔，常规培养后分别于24h、48h、72h后取样。每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，37℃培养4h后，再加入150μL的二甲基亚砜。低速震荡至溶解，在波长570nm下用酶标仪测定吸光度(OD值)，重复实验6次，计算各组细胞增殖抑制率，结果以(均数±标准差)表示[6-7]。

1.2.4 平板克隆形成实验

选取对数生长期的C/EBP β siRNA细胞和control siRNA细胞，消化离心，除去上清液，再用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次。取1000个细胞接种在6孔培养板中，每组设置3个重复孔，常规培养7d后终止培养。收板，用95%的乙醇固定后，再用0.1%的结晶紫染色，然后在显微镜下计算阳性克隆数(大于50个细胞的克隆被认定为阳性克隆)。计算克隆形成率(%)=阳性克隆形成数/接种细胞总数×100%[8-9]。

1.2.5 Transwell检测迁移能力

在Transwell下室加入含 20% FBS的培养基650μL，Transwell上室加入细胞悬液100μL，细胞含量约为2×105个，放置在细胞培养箱中培养48h。将Transwell小室放置在4%多聚甲醛溶液中，室温下固定20min后，用0.1%的结晶紫染色10min，再用棉签轻擦去小室内的细胞，PBS液清洗3次，每次洗5min左右。然后将小室风干，在显微镜下取6个视野并记录每个视野下的细胞数量，取平均值，结果用(均数±标准差)表示。

1.2.6 Transwell检测侵袭能力

先将matrigel基质胶从-20℃冰箱中取出，放在4℃冰箱中冷藏解冻，按照1∶8的比例用无血清培养基稀释matrigel基质胶。在每个小室加入稀释后基质胶45μL，在37℃的细胞培养箱中放置30min，待基质胶凝固后，再按照迁移能力的步骤开展后续实验，记录并计算细胞数量，所得数据即为细胞侵袭数。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 MTT法检测细胞增殖能力

用MTT法检测肺腺癌A549细胞增殖能力，作用72h后，C/EBP β-siRNA组抑制肺腺癌A549细胞增殖能力较control-siRNA组有显著性差异(P<0.01)，结果见图1。

图1 C/EBP β-siRNA抑制A549的增殖能力(n=3)

2.2 沉默C/EBP β抑制A549细胞平板克隆形成能力

在平板克隆形成实验中，与control-siRNA组相比，C/EBP β-siRNA组细胞克隆形成率显著降低(P<0.01)，结果见图2。

图2 沉默C/EBP β抑制A549平板克隆形成能力(n=3)

2.3 沉默C/EBP β对肺腺癌A549细胞迁移能力的影响

Transwell小室实验结果见图3(封三)，两组数据差异有显著性统计学意义(P<0.01)。由此可见，沉默C/EBP β-siRNA组细胞迁移能力明显弱于control-siRNA组。

2.4 沉默C/EBP β对肺腺癌 A549 细胞侵袭能力的影响

Transwell小室实验结果见图4(封三)，两组数据差异有显著性统计学意义(P<0.01)。由此可见，沉默C/EBP β-siRNA组细胞侵袭能力明显弱于control-siRNA组(P<0.01)。

3 讨 论

肺腺癌是非小细胞肺癌中占比较多的病理类型，患病率较高，且容易发生转移、局部浸润，临床以手术、放疗、化疗为主要治疗方法。目前对肺腺癌的发病机制尚不完全清楚，在早期存在一定的隐匿性，缺少具有特异性、敏感性的诊断指标，同时早期肺腺癌无特异性症状，患者很容易错过最佳治疗时机，在确诊时往往已到晚期[10]，5年总生存率仅有不到20%[11]。随着精准医疗的不断发展，选择可靠的分子靶点，从分子层面研究肺腺癌进展机制，尽可能在早期抑制肺腺癌的增殖、侵袭、转移，对临床早期诊断、治疗肺腺癌提供有效的方法有着重要的临床意义。

肿瘤细胞具有较强的增殖能力，且增殖速度远远超过正常细胞。MTT法通过活细胞染色及个性化筛选可以检测细胞生长和存活，有效检测化疗药物对肿瘤细胞的敏感性，且检测结果与临床疗效相吻合。利用MTT检测肺腺癌A549细胞增殖能力可以为临床判断肺腺癌预后及药物反应提供一定的数据支撑[12]。单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体即为细胞克隆，克隆形成的大小和多少在一定程度上反映了肿瘤细胞的增殖能力[6]。肿瘤死亡率高的主要原因包括肿瘤细胞的转移，而肿瘤细胞的迁移、侵袭又是发生转移的前提，同时也受多种调控机制影响[3]。

C/EBP β是碱性亮氨酸拉链结构转录因子，具有普遍生物学功能，参与细胞侵袭、增殖、凋亡等细胞分子事件，可影响肿瘤的发生、发展进程[1]。越来越多的研究证实C/EBP β在恶性肿瘤生物学行为中起致瘤性作用，但是在肺癌，尤其是肺腺癌中的作用还未完全阐明。

C/EBP β的表达失调与肿瘤恶化程度密切相关[1]。本研究通过细胞实验分析C/EBP β对肺腺癌 A549细胞增殖、平板克隆形成、迁移、侵袭的影响，不难发现，沉默C/EBP β对肺腺癌A549细胞有明显的抑制作用，我们的研究结果提示C/EBP β可辅助诊断早期肺腺癌，并可作为肺腺癌患者的预后评价指标，为临床肺腺癌诊治、预后提供参考，但具体作用机制有待进一步探索。