香青兰总黄酮对T2DM大鼠胰岛功能的影响及作用机制研究

许月娇

(郑州二砂医院中西医结合内科，河南 郑州 450000)

糖尿病作为临床高发病种，其中以2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)发病人群最多，主要以慢性高血糖为特征，患者可出现胰腺β细胞功能障碍和外周组织胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)[1]。2011年，有研究者在“Nature”发表文章，证实T2DM是一种以胰岛素抵抗为主要特征的慢性炎症性疾病，降低机体炎症反应对T2DM患者糖代谢紊乱具有重要意义[2]。炎症因子对细胞膜上的葡萄糖转运蛋白具有抑制作用，抑制胰岛素信号传导，使血清中葡萄糖含量升高，引发胰岛素抵抗[3]。现代医学对糖尿病治疗主要通过口服降糖药物配合胰岛素注射，但长期使用西药会出现高胰岛素血症、药物易失效等问题[4]。近年来，众多研究者通过中药、中药单体、中药复方研究展开糖尿病实验研究，取得不错的成就。中医药注重整体观念，辨证施治的思维，全面把控疾病，且不良反应较轻，这对糖尿病及其并发症的治疗具有西医不可取代的优势[5]。中药香青兰(Dracocephalum Moldavica L.)隶属唇形科植物，具利尿止咳、补益心脑、活血化痰、止痛解毒之功，目前临床主要用于冠心病、动脉硬化、高血压、心肌缺血、心绞痛等疾病的治疗，化学成分较多，主要包括甾体类与三萜类、挥发油类、蛋白质类、黄酮类、苯丙素类等成分[6-7]。香青兰中黄酮类化合物近年来因作用广泛被众多研究者关注。康小龙等[8]通过实验研究发现，香青兰总黄酮可抑制哮喘CRP、LTB4、LTC4、TNF-α、IL-6、IL-13和IL-17等炎症因子的释放，在抗炎方面具有显著药效。本次研究通过建立T2DM模型，基于炎症反应观察香青兰总黄酮对T2DM大鼠胰岛功能影响及作用机制研究，为香青兰的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

血糖仪(强生稳捷)；高速冷冻离心机(型号：H1650R，湖南湘仪)；全自动酶标仪(型号：DY001292，苏州吉诺瑞生物科技有限公司)；电子秤(型号：BT457A，深圳市博途电子科技有限公司)；生物显微镜(型号：S800T-T310，苏州倍特嘉光电科技有限公司)。

1.2 药品与试剂

香青兰总黄酮(宝鸡晨光生物科技有限公司，每100g香青兰药材含香青兰总黄酮52.35g)；盐酸二甲双胍(中美上海施贵宝制，批号：20190622，规格：0.5g)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，批号：S0130，规格：100 mg)；柠檬酸钠、柠檬酸(成都市恒亿化工产品有限公司，批号分别为20190613、20190325)；胰岛素(INS，批号：E20191023A)、胰岛素抗体(IAA，批号：E20190915A)、肿瘤坏死因子(TNF-α，批号：E20190925A)、白介素-1β(IL-1β，批号：E20191017A)、白细胞介素-6(IL-6，批号：E20191005A)、白介素-18(IL-18，批号：E20191013A)、C-反应蛋白(CRP，批号：E20191011A)、瘦素(LP，批号：E20191019A)、脂联素(ADPN，批号：E20190928A)、高迁移率族蛋白1(HMGB1，批号：E20190907A)试剂盒均购自苏州卡尔文生物科技有限公司；苏木素-伊红(HE)染色液(北京索莱宝科技有限公司，批号：G112)。

1.3 动物

动物级别：SPF级；品系：SD大鼠；数量：75只；性别：雄性；周龄：7～8周龄；体质量：220～240g，供应单位：济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)20190003。高脂高糖饲料(1.5%胆固醇、10%猪油、0.25%胆酸钠、5%蔗糖、83.25%普通饲料，济南朋悦实验动物繁育有限公司)。

1.4 方法

动物置适应性喂养7d，饲养室温度控制在25℃，湿度45%～75%。随机选取12只为空白组，采用普通饲料正常饲养，剩余动物采用高脂饲料连续喂养4周，一次性舌下静脉注射STZ 60mg/kg(注射剂量根据前期预实验成模率进行确定)，7d后血糖仪测定造模动物空腹动态血糖值，取血糖值在16.7～24.00mmol/L范围内且具有明显多饮、多食、多尿症状大鼠52只为成模动物，随机分为模型组、盐酸二甲双胍组、香青兰总黄酮高剂量组、香青兰总黄酮低剂量组，每组12只(实验过程中，低剂量组及盐酸二甲双胍组均死亡1只，为保证结果平行，最终实验结果以每组10只进行检测统计)，各组动物分别给予相应药物灌胃，盐酸二甲双胍组(167mg/kg)，香青兰总黄酮高剂量组(200mg/kg)，香青兰总黄酮低剂量组(100mg/kg)给药剂量参照文献[9]，各组动物给药体积为2mL/100g，1次/d，连续给药6周。为保证实验平行性，空白组和模型组需灌胃同等体积生理盐水。

1.5 指标监测

1.5.1 动态血糖检测

分别于第2、4、6周检测各组动物空腹血糖值。

1.5.2 血清指标检测

各组动物末次给药2h后，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，腹主动脉插管收集血清，3 500r/min，15min离心，检测INS、IAA、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、LP、ADPN、HMGB1含量。

1.5.3 病理指标检测

摘取胰腺置10%甲醛溶液中固定48h以上，脱水，石蜡包埋，切片(厚度4～6μm)，进行HE染色，置于光学显微镜下观察各组动物胰腺病理变化。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组空腹动态血糖值比较

与空白组比较，模型组动物空腹血糖值自建模后至第6周均异常升高，具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，盐酸二甲双胍组及香青兰总黄酮高剂量组自建模第2周起空腹血糖值均呈现不同程度降低趋势，具有统计学意义(P<0.05)，香青兰总黄酮低剂量组自建模第4周起动态血糖值不同程度降低，具有统计学意义(P<0.05)，结果见表1。

表1 对T2DM大鼠模型空腹动态血糖值影响

2.2 各组大鼠血清INS、IAA含量比较

与空白组比较，模型组大鼠血清INS含量显著降低，IAA含量显著升高，具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，盐酸二甲双胍组及香青兰总黄酮高剂量组均可显著提升大鼠血清INS水平，降低IAA含量，具有统计学意义(P<0.01)，香青兰总黄酮低剂量组也可明显提升大鼠血清INS水平，降低IAA含量，具有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。

表2 对T2DM大鼠模型血清INS、IAA含量影响

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量比较

与空白组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量显著升高，具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，盐酸二甲双胍组及香青兰总黄酮高剂量组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量降低，具有统计学意义(P<0.01)，香青兰总黄酮低剂量组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量也不同程度降低，具有统计学意义(P<0.01)，结果见表3。

表3 对T2DM模型大鼠血清TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量影响

2.4 大鼠血清LP、ADPN、HMGB1含量比较

与空白组相比，模型组大鼠血清中LP、HMGB1含量显著升高，ADPN含量显著降低，具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，盐酸二甲双胍组及香青兰总黄酮高剂量组可显著降低模型动物血清中LP、HMGB1含量，升高ADPN含量，具有统计学意义(P<0.01)，香青兰总黄酮低剂量组也可不同程度降低动物血清LP、HMGB1含量，升高ADPN含量，具有统计学意义(P<0.01)。结果见表4。

表4 对T2DM模型大鼠血清LP、ADPN、HMGB1含量影响

2.5 大鼠胰腺组织影响

空白组胰岛边界清晰，细胞排列紧密，细胞核松散，胰岛细胞浆丰富；模型组胰岛皱缩，边界不清，细胞排列稍紊乱，胰岛细胞浆不丰富；盐酸二甲双胍组胰岛边界清晰，偶见界欠清胰岛，偶见胰岛中有空泡，胰岛细胞浆较丰富；香青兰总黄酮高剂量组胰岛细胞边界清晰，细胞排列紧密，偶见胰岛中有空泡，胰岛胞浆较丰富；香青兰总黄酮低剂量组胰岛细胞边界欠清晰，胰岛中有空泡，胞浆稍欠丰富。各组大鼠胰腺组织镜下观察见图1～5(封二)。

3 讨 论

本次研究是基于炎症反应基础上对T2DM模型进行药效学研究，通过模型组血糖水平及血清胰岛素水平可知模型复制成功。临床研究显示，T2DM患者多伴随机体内部炎症反应高于正常值，相关炎症指标异常升高，TNF-α是机体主要的促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应。研究[10]显示TNF-α可抑制葡萄糖载体4(GLUT4)及胰岛素底物1(IRS1)的表达，抑制IRS-1酪氨酸磷酸化，而使得IRS-1丝氨酸磷酸化增强，阻断胰岛素信号传导功能。

CRP是一种极性反应蛋白，由肝脏分泌，血清中CRP浓度与T2DM的发生发展呈正相关性。目前，血清CRP已成为临床最显著炎症标志物之一，成为T2DM的重要预测因子。而IL-6、IL-1β及TNF的转录可调控CRP的表达。正常情况下，胰岛素可抑制CRP释放，当机体呈现胰岛素抵抗时，CRP被抑制作用逐渐减弱，导致体内CRP水平升高，直接参与全身炎症反应，加剧IR及2型糖尿病的发展。IL-18作为一种促炎症细胞因子，与糖尿病多种并发症尤其是糖尿病肾病的发生密切相关，IL-18分泌的增加可诱导细胞凋亡，严重损伤肾小球，促进前列腺素释放，降低肾小球滤过作用，使蛋白漏出增多[10-11]。本研究显示，模型动物血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量均显著高于空白组，经香青兰总黄酮干预后以上指标均有不同程度降低，可知香青兰总黄酮可有效降低T2DM大鼠血清中炎症因子水平，降低炎症反应发生。

LP是一种特异性炎症因子，由脂肪组织分泌，与胰岛素的产生有着极大的关联，在胰岛素抵抗等病理情况下，瘦素增多则会造成脂肪组织胰岛素抵抗，即脂肪合成减少，分解增加，产生大量的游离脂肪酸而引起胰岛素抵抗[12]。ADPN是由脂肪细胞分泌的生物活性多肽，是胰岛素的增敏剂，在低血糖状态下可对胰岛素的分泌产生抑制作用；相反，当机体处于高血糖状态时，可促进胰岛细胞分泌胰岛素，用于衡量胰岛β细胞的功能[13]。本研究显示，模型组动物血清中LP含量升高，ADPN含量降低，经香青兰总黄酮干预后出现反转，LP含量降低，ADPN含量升高。

HMGB1属于一种染色质非组蛋白核蛋白，在所有真核细胞胞质内均有分布，参与细胞生长、增殖和分化等过程，在多种疾病的新生血管生成和组织细胞凋亡中起到重要作用，而HMGB1也是新近发现与2型糖尿病发生密切相关的血清学指标[14]。HMGB1可调控晚期糖基化终产物受体和Toll样受体2种信号转导途径使NF-κB表达上调，并进一步促进TNF-α合成、分泌，诱发和放大炎症反应，加重糖尿病病情[15]。本次研究发现模型动物血清中HMGB1含量明显升高，经过香青兰总黄酮各剂量组干预后血清含量明显降低，可推知，香青兰总黄酮的抗炎作用可能对HMGB1蛋白具有一定干预作用，从而降低糖尿病炎症反应的发生。

综上所述，香青兰总黄酮可有效降低T2DM模型动物血清中空腹动态血糖值，降低血清中IAA、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、HMGB1、LP水平，升高血清中INS、ADPN含量，修复受损胰腺，有效控制糖尿病病情。相关作用机制可能与调控机体HMGB1蛋白有关，阻断炎症信号传导，降低炎症反应发生。但确切作用机制需进一步深入探讨，明确香青兰总黄酮具体作用位点。