匹诺塞林对缺糖缺氧/复糖复氧SH-SY5Y细胞内质网应激凋亡通路相关蛋白的影响

武彩霞，李传厚，刘晓金，张晓明

(山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000)

匹诺塞林属于黄酮类化合物，蜂胶中含量较高，是中国医学科学院药物研究所研制的一种新型脑保护新药，目前已进入Ⅱ期临床研究阶段[1]。研究证实，该药治疗脑缺血再灌注损伤与抗氧化、抗炎、抗凋亡、血管舒张等多方面的作用有关[2-4]，但作用靶点仍然不清楚。研究显示，脑缺血再灌注后可引起内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)发生，导致蛋白质翻译水平下降和诱发细胞凋亡[5]。为探讨匹诺塞林脑保护的作用机制是否与减少ERS凋亡有关，本研究用缺糖缺氧/复糖复氧损伤SH-SY5Y细胞模拟脑缺血再灌注损伤模型，检测匹诺塞林对细胞凋亡和ERS凋亡通路PERK-eIF2α-CHOP/GADD153相关蛋白表达的影响，以期为寻找其作用靶点提供启示。

1 材料与方法

1.1材料 药品与试剂：匹诺塞林冻干粉(批号201704)；SH-SY5Y细胞株(中国医学科学院基础所)；DMEM/F12培养基、标准胎牛血清(均购自Gibco公司)；胰蛋白酶、L-谷氨酸、Hochest 33258、噻唑蓝(MTT)，均购自Sigma公司；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；钙离子荧光探针Fura-4/AM(Invitrogin公司)；一抗：GRP78、CHOP、ATF4、P-eIF2α(美国Santa Cruz Biotechnology公司)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司)；Dylight651-conjugated 荧光二抗(美国CST公司)。主要仪器设备：细胞孵育箱(日本三洋公司)，超净纯水仪(美国Beckman公司)，荧光显微镜IX71(日本Olympus公司)，Spectra Max M5酶标仪(美国Molecular Devices公司)，高内涵细胞成像仪(英国Thermo Fisher公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2方法

1.2.1SH-SY5Y细胞培养 SH-SY5Y细胞在DMEM/F12基质中培养，细胞呈对数增长时，接种在96孔培养板中(或接种于25 cm2培养瓶)，24 h后更换无糖EBSS平衡盐溶液，将其随机分为5组：对照组，更换完全培养基，正常条件下培养；缺糖缺氧/复糖复氧损伤组(OGD/R)，不加任何药物；匹诺塞林0.01、0.1、1μM三个剂量组。除对照组外，其他各组分别于三气培养箱中培养，培养条件：37℃、5%CO2、1%O2、94%N2，培养2 h后移除培养液，更换完全培养基，复糖复氧培养，培养条件：37℃、5%CO2，饱和湿度下培养12 h。每组细胞6孔，实验重复3次，数据分别处理。

1.2.2匹诺塞林对细胞活力及LDH的影响 96孔板细胞加入药物处理培养12 h后吸出培养液，加入无血清的培养基配制的MTT，终浓度为0.5 mg/mL，37℃继续培养4 h后移走MTT，每孔加入DMSO 150 μL，溶解，振荡后于Spectra Max M5酶标仪570 nm处测定吸光度OD值。以对照组细胞存活率为100%，计算不同处理组细胞的存活率。细胞活力计算如下：Viability(%)=[(OD给药组-OD损伤组)/OD损伤组]×100%；细胞释放LDH的测定按照试剂盒说明书操作。

1.2.3匹诺塞林对细胞凋亡的影响 细胞核Hoechest33324染色，观察细胞凋亡形态：96孔板药物处理12 h后，吸除培养基，PBS洗涤后加入含Hoechst33342的培养基(终浓度1μg/mL)，37℃避光孵育10 min，再用PBS洗涤，高内涵拍照分析。细胞凋亡率：药物处理12 h后，按照试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4匹诺塞林对ERS途径相关蛋白表达的影响 96孔板细胞药物处理12 h后，PBS洗涤细胞；预温的4%多聚甲醛固定20 min后，吸除固定液，PBS洗涤；0.5% Triton X-100/PBS室温孵育10 min，吸除Triton X-100/PBS，PBS洗涤；2%BSA/PBS 37℃孵育60 min，吸除封闭液，加入实验所需一抗50μL(1∶200)4℃孵育过夜；吸除一抗，PBS洗涤，加入Dylight495-conjugated羊抗兔荧光二抗50μL(1∶500)或Dylight651-conjugated驴抗羊荧光二抗50μL(1∶200)，37℃避光孵育2 h；吸除二抗，PBS洗涤2次后，加入Hochest(终浓度5μg/mL)，37℃避光孵育10 min；弃去上清，PBS洗涤，最后加入1×PBS 200μL于高内涵成像仪读数并拍照，注意避光操作。免疫荧光分析细胞内葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CHOP、ATF4、P-eIF2α表达的变化。

2 结果

2.1匹诺塞林对细胞活力及LDH的影响 与对照组比较，OGD/R组细胞活力明显下降、LDH释放明显增加(P<0.05)；与OGD/R组比较：匹诺塞林各剂量组随剂量增加细胞活力有逐步升高的趋势(P<0.05)；匹诺塞林各剂量组LDH释放减少，并随剂量的增高呈递降趋势(P<0.05)。见表1。

2.2匹诺塞林对细胞凋亡的影响 凋亡形态：对照组细胞核呈现均匀蓝色荧光，细胞核呈圆形，染色质均匀分布，极少数呈现固缩浓染的核；OGD/R组出现细胞凋亡，细胞核变小并发生浓缩，碎裂成三角形、圆形或多边形团块；匹诺塞林0.01、0.1、1μM各剂量组能明显改善上述凋亡相关细胞形态学变化(见封三图1)。凋亡率：与对照组比较，OGR/D组明显升高(P<0.05)；与OGD/R比较，匹诺塞林能减少细胞凋亡，并随剂量的增高呈递降趋势(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞活力、LDH及凋亡率的比较

2.3匹诺塞林对ERS途径相关蛋白表达的影响 GRP78：与对照组比较，OGD/R组GRP78表达显著增加(P<0.05)；与OGD/R组比较，匹诺塞林能增高GRP78的表达，且随剂量增加有逐步升高的趋势(P<0.05)；CHOP、P-eIF2α及ATF4：与对照组比较，OGD/R组三者表达均显著增加(P<0.05)；与OGD/R组比较，匹诺塞林能降低三者表达，且随剂量的增高呈递降趋势(P<0.05)。见表2，封三图2-5。

表2 各组ERS凋亡蛋白表达的比较荧光值)

3 讨论

脑组织缺血后首先引起脑细胞氧及葡萄糖的耗竭，体外OGD/R模型可较好地模拟体内脑缺血再灌注对细胞造成的损伤[6]。SH-SY5Y细胞株来源于人类胚胎中脑组织，其细胞形态、生理生化功能与正常神经元相似，可选取SH-SY5Y细胞制作OGD/R模型。匹诺塞林可减轻缺糖缺氧/复糖复氧SH-SY5Y损伤，减少细胞凋亡，在体外进一步确证了其减轻脑缺血再灌注损伤的作用。

ERS是指内质网的稳态遭受缺血缺氧等有害因素的破坏，出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态。ERS发生时细胞自身可通过减少蛋白质的合成，或增强内质网的蛋白折叠功能及内质网相关性蛋白降解，恢复细胞内环境的稳定，提高细胞在有害因素下的生存能力[7]。但是，当ERS非常剧烈或者持久时，细胞损伤过于严重，ERS不能使细胞内环境稳态及时恢复到正常，最终凋亡机制就会被触发，导致细胞死亡[8-9]。有研究认为，脑缺血再灌注能引发ERS，造成神经细胞凋亡，促进脑缺血再灌注损伤的发生发展[5]。

GRP78是ERS的经典标志物，参与蛋白质折叠修饰，并可以作为钙结合蛋白维持细胞内钙离子平衡。ERS发生时，GRP78大量表达并与内质网中错误折叠和未折叠蛋白结合，恢复蛋白质正确构象，维持内环境稳定。本实验中，SH-SY5Y细胞在缺糖缺氧/复糖复氧损伤后，GRP78表达上调，说明缺糖缺氧/复糖复氧可引发ERS，而匹诺塞林能进一步增加GRP78的表达，这可能是其对脑缺血再灌注损伤发挥细胞保护作用的机制之一。

CHOP是内质网应激特异的转录因子，正常情况下细胞内表达非常低。当ERS发生时，其转录和表达明显增加，是ERS引起细胞凋亡的主要信号转导通路之一[10]。关于CHOP凋亡通路，尚未完全清楚，考虑与抑制Bcl-2表达、诱导氧化应激有关。因此，CHOP表达可能与细胞凋亡关系密切[11]。本实验证实，缺糖缺氧/复糖复氧SH-SY5Y细胞CHOP表达增加，匹诺塞林能降低其表达，这也可能是其减少细胞凋亡的原因。

ERS发生时，PERK-eIF2α-ATF4是CHOP蛋白表达增高最主要的通路[12]。PERK发生自身磷酸化被激活，然后特异性磷酸化eIF2α，降低新生蛋白的翻译速率，保护内质网的功能。但同时还会导致转录因子ATF4上调。ATF4进入胞核后激活CHOP的表达。本实验结果表明，在缺糖缺氧/复糖复氧SH-SY5Y细胞模型中，P-eIF2α和ATF4表达均升高，匹诺塞林能降低二者的表达，这个趋势与CHOP的表达趋势一致。推测匹诺塞林下调CHOP的表达可能是通过调控其上游PERK-eIF2a-ATF4通路实现的。

综上所述，缺糖缺氧/复糖复氧能使SH-SYHY细胞发生ERS，使CHOP表达增加，造成细胞损伤引发凋亡。匹诺塞林在ERS发生时，一定条件下能提升GRP78的表达，稳定内质网功能，发挥细胞保护作用，同时通过调控PERK-eIF2a-ATF4通路，降低CHOP表达，减少缺糖缺氧/复糖复氧SH-SYHY细胞的凋亡。该研究结果可为深入探讨匹诺塞林治疗脑缺血再灌注提供新的启示。