响应面法优化独一味多糖酶解提取工艺

2022-01-08高飞邵湘玲李雨婷范潇刘志海

当代化工研究 2021年23期

＊高飞邵湘玲李雨婷范潇刘志海

（青岛农业大学化学与药学院山东 266109）

独一味（Lamiophlomis rotate(Benth.)Kudo）是藏药中十分出色的一味中药，已在少数民族中广泛使用，该药最早载于藏族医药学巨著《四部医典》及《晶珠本草》中，且历史悠久。书中记载该药味甘、微苦，温，主接骨、干黄水[1-2]。在现代临床医学学研究中，该药多用于膏药，主要治疗跌打损伤、筋骨疼痛等，其主要作用在于镇痛、消炎。国内外研究报道，独一味具有抗氧化、抗炎镇痛的药理活性，但全部关注于独一味中的环烯醚萜类，对其中多糖组分的生物学功能未见有报道[3]。

多糖是生命活动中不可或缺的一部分，能够维持和保证生物体生命活动正常运转[4]。据研究表明，天然植物多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒及抗氧化等多种药理作用，在绿色天然产物领域是不可多得的优秀免疫调节剂，深得国内外学者追捧[5]。目前，提取植物多糖的方法有水提醇沉法、酸提取法、碱提取法、微波及超声提取法等多种方法[6-8]。研究报道，使用水提醇沉法可获得独一味多糖，但该提取方法提取率低，而独一味为名贵中药，无法发挥其最大价值。酶尤其是果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶，其活性高、易得价廉，可应用于植物多糖的提取，因此本研究使用酶解提取，并优化其提取工艺。

1.材料与方法

(1)材料与仪器

①试剂

无水D-葡萄糖对照品（批号：110833-201205，纯度：95%～98%），购自中国食品药品检定研究院；独一味，购自青藏高原地区；纤维素酶（400U/g）（CAS：9012-54-8）、果胶酶（500U/g）（CAS：9032-75-1）、木瓜蛋白酶（800U/g）（CAS：9001-73-4），购自福州飞净生物科技有限公司；80%乙醇、浓硫酸、苯酚均为分析纯。

②仪器

循环水多用真空泵（SHZ-D(Ⅲ)型，郑州英峪领科仪器设备有限公司），恒温水浴锅（HH-4A型，常州国华电器有限公司），超声波清洗仪（KQ5200DA型，杭州博可超声波设备有限公司），紫外/可见分光光度计（UV-110011型，上海天美科学仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（智拓科技控股有限公司），电子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多仪器有限公司），高速粉碎机（H5322型，邢台中德机械制造有限公司），pH测试仪（上海佑科仪器仪表有限公司）。

(2)试验方法

①独一味脱脂

将独一味粉末用回流瓶经80%的乙醇加热8h，用于脱脂、脱色、除去低聚糖和小分子杂质，置于干燥通风处，挥干溶剂，得到干燥样品[8]。

②糖含量测定

精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.01g，溶解于超纯水，定容至100mL，得0.1mg/mL溶液。精密吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL并加超纯水补至2mL，分别加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，垂直液面快速加入浓硫酸5mL，摇匀。冷水浴至温度下降到室温，显色。以空白为对比，将样品置于紫外分光光度计上，测定其在490nm处的吸光度值。

绘制标准曲线，得到回归方程y=0.0063x-0.0077（R2=0.9992），其中x为葡萄糖标准品浓度，单位mg/mL，y为吸光度值[9-10]。

精密称取独一味多糖1mg溶解于10mL蒸馏水中，配制成0.1mg/mL溶液。吸取1mL加蒸馏水至2mL，加入5%苯酚1mL，摇匀，然后迅速垂直加入浓硫酸5mL，充分摇匀。冷水浴至温度下降到室温，于490nm处测定吸光度。根据标准曲线计算独一味多糖浓度，并计算多糖得率（Y）：

Y：多糖提取率（%）；C：通过对标准葡萄糖标曲计算得到多糖浓度（mg/mL）；V：定容体积（mL）；N：稀释倍数；m：测定所用的多糖质量（mg）；M：多糖质量（g）；W：提取用独一味粉末质量（g）。

③单因素考察

A.温度对独一味多糖提取的影响

称取3g预处理样品，加入适量蒸馏水，浸泡2h，复合酶（果胶酶:纤维素酶:木瓜蛋白酶=2:2:1）用量2%、提取温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）、pH为6，水浴浸提90min，于100℃将酶灭活5min，弃沉淀，将上清液减压浓缩至原体积20%，加入无水乙醇，使得乙醇终浓度为80%，置于4℃醇沉12h。弃上清液，收集沉淀真空干燥得独一味多糖（LRP），计算多糖提取率[11]。

B.时间对独一味多糖提取的影响

取3g预处理样品，加入适量蒸馏水，浸泡2h，在复合酶用量2%，温度40℃，pH为6，提取时间（30min、60min、90min、120min、150min）条件下进行操作，同1.2.3.1，计算多糖提取率[12]。

C.pH对独一味多糖提取的影响

称取3g预处理样品，加入适量蒸馏水，浸泡2h，在复合酶用量2%，温度40℃，pH（4、5、6、7、8），提取90min条件下进行操作，同1.2.3.1，计算多糖提取率[13]。

④响应面优化设计

通过单因素试验，利用Box-Behnken Design（BBD）中心组合方法设计响应面试验，其中，响应值为LRP提取率Y（%），将单因素试验中三个独立变量分别进行考察，即提取温度（A）、提取时间（B）和pH（C）（每个因素取3个平行实验对照，分别以1、0、-1对每个自变量的高、中、低实验水平进行编码）。实验因素和水平见表1所示，所有实验均进行3次，并利用Design-Expert（8.0.6.1版）)软件进行数据处理分析。

表1 BBD响应面试验因素与水平表

⑤验证试验

选取响应面试验分析得出的最佳工艺参数作为提取条件，重复三次得到试验结果，计算三颗针多糖得率，以确定三颗针多糖的最优提取工艺。

⑥紫外可见吸收光谱

配制1mg/mL的三颗针多糖溶液，以蒸馏水调零，于紫外分光光度计中200-800nm范围内全波长扫描。

⑦FTIR光谱

取2mg干燥的三颗针多糖粉末，与150mg溴化钾混合研磨均匀后压片，于红外谱仪中400-4000cm-1范围进行扫描。

⑧数据分析

利用Design-Expert V8.0.6.1软件进行响应面试验设计及回归模型分析。

2.结果与分析

(1)单因素对多糖得率的影响

①提取温度对独一味多糖得率的影响

如图1所示，在固定pH为6，复合酶添加量为2%，酶解时间90min条件下，酶解温度20℃～50℃时，温度升高与多糖得率成正效应关系，之后进一步提高酶解温度则多糖得率下降。试验中，提取温度由20℃提升到50℃，多糖的提取率不断上升，然而在温度高于50℃时，多糖提取率出现了显著的下降。其原因是温度可以提高多糖在溶剂中的溶解度、扩散系数，使得多糖在提取时更容易沉淀，有利于多糖提取；但是，温度过高会使得多糖降解，破坏多糖结构，从而导致提取率降低。因此，提取温度选择在40℃、50℃、60℃上进行响应面设计。

图1 提取温度对独一味多糖得率的影响

②提取时间对独一味多糖得率的影响

如图2所示，在固定pH为6，复合酶添加量为2%，酶解温度40℃条件下，酶解时间30min～90min时，提取时间增加与多糖得率成正效应关系，之后进一步增加提取时间则多糖得率下降，因此选择提取时间60min、90min、120min进行响应面设计。

图2 提取时间对独一味多糖得率的影响

③pH对独一味多糖得率的影响

如图3所示，在固定复合酶用量2%，提取温度40℃，提取时间90min条件下，在pH为5～7时，多糖得率与pH值成正效应，在pH为8时多糖得率下降，可能是过碱条件下，酶的空间结构受到了破坏，影响了与底物的结合，从而使提取得率下降，因此应选择在pH为6、7、8较宜。

图3 pH对独一味多糖得率的影响

(2)响应面法优化独一味多糖提取工艺

①模型的建立与检验

以提取温度（A）、提取时间（B）、pH（C）为变量，独一味多糖得率为响应值，利用Design-Expert V8.0.6.1软件中Box-Behnken设计法进行三因素三水平的响应面优化试验，每个试验重复3次，结果见表2。

表2 响应面设计及结果

②回归方程拟合及方差分析

利用Design-Expert V8.0.6.1软件对表2试验结果进行回归模型拟合，对三个因素进行回归拟合后得到回归方程：Y=4.33+0.14A+0.12B+0.26C-0.29AB-0.19AC+0.82BC+1.32A2+0.32B2+0.91C2。

拟合二次多项式模型的方差分析结果见表3。校正系数R2=0.9339，R2模型的P值小于0.01，为极显著；失拟项P值大于0.05，不显著，以上说明模型拟合度较好，二次模型拟合度较高，可正确反映各因素与响应值之间的变化关系。由模型的方差分析可得出，二次项A2、C2以及交互项BC系数的显著性均小于0.05，其余一次项、二次项和交互项系数的显著性均大于0.05。三个因素对响应值的影响显著性排序为C＞A＞B。

表3 拟合二次多项式模型的方差分析

③3D响应面和等高线图分析

响应面和等高线图可直观反映两因素间的交互作用。响应面图越陡峭表明两自变量间交互作用对响应值影响程度越大，反之亦然。等高线图越密集，呈现椭圆时表明两变量间交互作用对响应值影响较显著，反之亦然。分析结果见图4-图6。

由图4可知，3D响应面图显示，多糖的得率受提取温度和提取时间共同影响，且成正相关，提取温度的升高和提取时间增加，多糖得率增加，且在提取温度和时间达到最高值时，多糖得率出现下降的趋势。由等高线图可以表明，等高线沿提取温度轴变化密集，说明提取温度对响应面的影响明显显著于提取时间。

图4 提取温度和提取时间对独一味多糖得率的影响

由图5可知，3D响应面图显示，多糖的得率受提取时间和pH共同影响，且与提取时间呈现正相关，与pH值呈现负相关，即提取时间的增加、pH的降低，多糖得率增加，且在提取时间达到最高值和pH值达到最低值时，多糖得率出现下降的趋势。由等高线图可以表明，等高线沿pH值轴变化密集，说明pH值对响应面的影响明显显著于提取时间。

图5 提取时间和pH对独一味多糖得率的影响

由图6可知，3D响应面图显示，多糖的得率受提取温度和pH共同影响，且与提取温度呈现正相关，与pH值呈现负相关，即提取温度的增加、pH的降低，多糖得率增加，且在提取温度达到最高值和pH值达到最低值时，多糖得率出现下降的趋势。由等高线图可以表明，等高线沿pH值轴变化密集，说明pH值对响应面的影响明显显著于提取温度。

图6 提取温度和pH对独一味多糖得率的影响

(3)紫外吸收光谱结果分析

独一味多糖的紫外吸收图谱如图7所示，独一味多糖在280nm处有轻微吸收峰，表明该多糖中有蛋白的存在[16]；在260nm处无吸收峰，表明该多糖中无核酸的存在[17]。

图7 独一味多糖紫外吸收图

(4)红外光谱结果分析

如图8所示，在3600cm-1～3000cm-1处，有一个吸收较强的宽峰，3420.16cm-1和3389.46cm-1，为-OH伸缩振动峰；在1399.81cm-1处有振动吸收峰，是C-H变角振动峰[18-19]；在1168.68cm-1处的吸收峰是由吡喃糖环的醚键（C-O-C）和-OH伸缩振动引起的，此4组吸收峰均是糖类物质的特征吸收峰，说明本研究中的提取物为多糖类物质[20-21]。另外654.66cm-1处有一强的吸收峰，为酰胺Ⅰ带的吸收峰；558.26cm-1是N-H的变角振动，为酰胺Ⅱ带的吸收峰[22]，证明多糖中有少量的与糖结合的蛋白（如糖蛋白）存在。

图8 独一味多糖红外吸收光谱

(5)验证试验

通过使用Design-Expert 8.0.6.1软件，预测模型极值点，计算结果显示最佳提取条件为：提取温度60℃，提取时间60min，pH为6，在此最佳提取条件下预测多糖得率为7.95%。之后，按照优化后提取条件进行3次平行试验，最终测得多糖得率为（7.93±0.02）%，与预测值接近，差异不明显，表明该模型拟合度良好[23]，因此，提取温度60℃，提取时间60min，pH为6时提取独一味多糖的工艺优化合理、有效。