HPLC法同时测定复方黄藤洗液中3个有效成分及2种防腐剂的含量

黄慧，孙煜，何虹，卢日刚

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530299；2.广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530022)

复方黄藤洗液具有清热解毒，杀虫止痒的功效,主要用于湿热带下(外阴炎，阴道炎)和皮肤瘙痒等症的辅助治疗，其处方由牛白藤、漆大姑、栀子、黄芩、土茯苓、白及、蛇床子、黄藤、桉油、冰片、醋酸氯己定组成，并加入苯甲酸钠和羟苯乙酯作防腐剂。黄藤是我国传统中药,其有效成分盐酸巴马汀具有抗炎、抑菌等作用[1]，黄芩苷为方中黄芩的主要有效成分，其药理作用广泛，包括抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用[2]。醋酸氯己定作为常用抗菌剂或消毒剂,具有很强的抑菌作用和较好的杀菌效果，并且有研究证明含醋酸氯己定成分的洗液在妇科炎症的治疗中疗效显著[3-4]。

处方中苯甲酸钠和羟苯乙酯是常用的化学防腐剂，均对人体有一定毒性，用量过多可能危害人体健康，导致患者出现皮肤刺激或过敏，羟苯酯类的过量使用还可能有类激素作用，增加乳腺癌风险[5]；而用量不足，防止微生物污染的能力不足，又可能导致药品霉变、酸败，直接影响药物的产品质量和用药安全[6]。

复方黄藤洗液现行标准只规定了盐酸巴马汀含量的测定方法，尚未见同时测定复方黄藤洗剂中盐酸巴马汀、黄芩苷和醋酸氯己定3个成分的报道，也未见对其防腐剂的研究。为有效控制药品质量，保证其疗效，本研究在参考文献[7-9]的基础上，采用 HPLC 同时测定复方黄藤洗剂中3个有效成分(盐酸巴马汀、黄芩苷和醋酸氯己定)及2种防腐剂(苯甲酸钠、羟苯乙酯)含量，为复方黄藤洗剂标准的提高提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 XS205DU电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪(含 DAD 检测器，美国赛默飞世尔公司)；Milli-Q A10超纯水机(美国密理博公司)。

1.2 试药 黄芩苷对照品(批号：110715-202122，含量：94.2%，)、苯甲酸钠对照品(批号：100433-201702，含量：99.7%)、盐酸巴马汀对照品(批号：110732-201913，含量：85.7%)、醋酸氯己定对照品(批号：100183-201604，含量：96.3%)、羟苯乙酯对照品(批号：100847-201604，含量：99.9%)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈(德国默克公司，色谱纯，批号：JA090630)；三乙胺(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20190130)；磷酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：201881109)；复方黄藤洗液(广西德联制药有限公司，批号：20200403、20200404、20200405)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Xbridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；0.01 mol·L-1磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.15 g，加800 mL水溶解，加入5 mL三乙胺，再加水稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH值至2.80)为流动相A，乙腈为流动相B，流速为1.0 mL·min-1；待盐酸巴马汀出峰后，立即按表1进行梯度洗脱；检测波长为230、259、274 nm，其中230 nm检测苯甲酸钠，259 nm 检测醋酸氯己定、羟苯乙酯，274 nm检测黄芩苷、盐酸巴马汀。进样量为10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 称取各对照品适量，置于量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为各对照品储备液(各组分质量浓度分别为黄芩苷0.192 3 mg·mL-1、盐酸巴马汀0.412 0 mg·mL-1、醋酸氯己定0.207 2 mg·mL-1、苯甲酸钠1.626 3 mg·mL-1、羟苯乙酯0.206 2 mg·mL-1)。精密量取各组分对照品储备液各1.5 mL，置于同一20 mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取样品摇匀，精密量取3 mL，置50 mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 稀释液的制备 稀释液为0.01 mol·L-1磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵1.15 g，加800 mL水溶解，加入5 mL三乙胺，再加水稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH值至2.80)-乙腈(75∶25)。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 取混合对照品溶液、供试品溶液及溶剂空白，按“2.1”项下色谱条件测定并记录色谱图，结果见图1。结果显示，供试品溶液中各成分在对照品相同保留时间处均有相应的色谱峰，且溶剂空白无干扰，在该色谱条件下，黄芩苷、盐酸巴马汀、醋酸氯己定、苯甲酸钠、羟苯乙酯与其他成分均可达到基线分离，分离度均>1.5，具有良好的分离效果。用 DAD检测器进行峰纯度检查，纯度因子均满足阈值限值要求(阈值为990)。

2.3.2 线性关系考察 取“2.2.1”项下各组分对照品储备液，用稀释剂稀释成不同质量浓度的混合对照品标准曲线溶液，按“2.1”项下色谱条件，进行测定。分别以对照品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归分析。结果显示，各组分在相应的浓度范围内线性关系良好(见表2)。

表2 各组分线性关系

2.3.3 密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续测定6次，测定峰面积，以峰面积考察精密度，黄芩苷、盐酸巴马汀、醋酸氯己定、苯甲酸钠、醋酸氯己定、峰面积RSD分别为0.13%、0.09%、0.10%、0.13%、0.10%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取供试品(批号：20200403)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果黄芩苷的平均含量为0.23 mg·mL-1，RSD为0.7%(n=6)，盐酸巴马汀的平均含量为0.57 mg·mL-1，RSD为0.4%(n=6)，醋酸氯己定峰的平均含量为0.22 mg·mL-1，RSD为0.4%(n=6)，苯甲酸钠的平均含量为1.88 mg·mL-1，RSD为0.6%(n=6)，羟苯乙酯的平均含量为0.21 mg·mL-1，RSD为0.4%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号：20200403)，按“2.1”项下色谱条件，在0、2、5、8、12、16、20、24 h时进样测定，测得黄芩苷、盐酸巴马汀、醋酸氯己定、苯甲酸钠、羟苯乙酯峰面积RSD分别为0.3%、0.3%、0.3%、0.4%、0.3%、0.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验 采用加样回收率试验方法，取同一批供试品(批号：20200403)1.5 mL 9份，每3份平行，分别置50 mL量瓶中，按对照品加入量约相当于所取供试品中待测组分量的50%、100%、150%分别精密加入各对照品储备液适量，并加稀释剂定容至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算回收率，结果见表3。

2.3.7 样品含量测定结果 取样品3批，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进行测定，另取对照品溶液同法测定。按外标法以峰面积计算含量，结果见表3。

表3 各组分含量测定结果

表3 加样回收率试验结果(n=9)

3 讨论

3.1 波长的选择 结合高效液相色谱检测得到的5种成分 DAD 紫外吸收图谱，在该色谱条件下，黄芩苷在274、344 nm的波长处有最大吸收，盐酸巴马汀在227、274、344 nm的波长处有最大吸收，醋酸氯己定在232、259 nm的波长处有最大吸收，苯甲酸钠在274、344 nm的波长处有最大吸收，羟苯乙酯在274、344 nm的波长处有最大吸收。为使各组分的检测均有较大的吸收，最终选定230、259和 274 nm 作为测定波长。其中，230 nm作为苯甲酸钠的检测波长；259 nm 作为醋酸氯己定及羟苯乙酯的检测波长；274 nm 作为黄芩苷及盐酸巴马汀的检测波长。

3.2 色谱柱的选择 比较了不同品牌色谱柱Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和Kromasil 100A C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)的使用情况，二者均能有效分离各组分，各组分出峰顺序稍有差异，但均能达到基线分离，分离度均符合要求，各组分峰形也较好。

4 结论

本研究建立的高效液相色谱法能够有效分离并同时测定复方黄藤洗剂中3个有效成分(盐酸巴马汀、黄芩苷和醋酸氯己定)及防腐剂(苯甲酸钠、羟苯乙酯)含量，方法操作简单，专属性强，准确度高，为更全面的控制本品种的质量提供了科学依据。