丹参灵芝三七茶辅助降血脂作用及安全性研究

孙晶，张娟，郭海霞，赵钊

(1.山东省食品药品检验研究院，山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，山东 济南 250101；2.山东大学齐鲁医院肿瘤中心，山东 济南 250012)

高脂血症(hyperlipoidemia，HLP)是由于人体血脂代谢紊乱引起总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等血清中脂质和脂蛋白异常升高或降低造成的一种慢性疾病[1]。长期高脂血症容易引发动脉粥样硬化，导致冠心病、冠脉综合征、脑梗死等心脑血管疾病[2-3]。临床上常采用他汀类、贝特类、烟酸类、依折麦布、胆酸螯合剂等传统西药进行治疗[4-6]，近几年又有1G08、LY3015014和BMS-962476等PCSK9抑制剂上市[7]，但均有一定的副作用。本研究采用药食同源的丹参、灵芝、三七与红茶等制成保健食品袋泡茶，探索其降血脂作用，并对其安全性进行评价。

1 材料

1.1 受试样品 丹参灵芝三七茶，丹参、灵芝、三七、红茶等经粉碎、混合、灌装制成，山东某生物科技有限公司提供，规格为3.3 g/袋，推荐服用量为每次2袋，每天2次。

1.2 试验动物 SPF级Wistar大鼠体重(200±10)g、SPF级昆明种小鼠体重(20±2)g，均由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证：SCXK(京)2012-0001，鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌购自美国Moltox公司，经生物学鉴定符合试验要求。

1.3 主要仪器与试剂 动物天平(日本岛津UW2200H，上海锐析仪器设备有限公司)；电子天平(EX-E，天津市德安特传感技术有限公司)；酶标仪(HBS-1101，南京德铁实验设备有限公司)；快速血脂测定仪(东芝TAB-120，南京丰运医疗仪器有限公司)；TC、TG、HDL-C、LDL-C试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 高脂模型饲料 在维持饲料中添加20.0%蔗糖、15%猪油、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠，以及适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉，制成高脂模型饲料。

2 方法

2.1 提取工艺筛选与验证 本品为袋泡茶剂，无特殊推荐饮用方法，参考《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中受试样品的处理方法设计正交试验，以加水量、提取温度、提取时间、提取次数为考察因素，以浸膏得率为考察指标，按照正交L9(34)进行提取试验，筛选提取工艺参数。另取一定量受试样品，按正交试验获得的最佳工艺条件进行工艺验证试验。

2.2 辅助降血脂功能试验

2.2.1 样品制备 将规格样品按筛选的最佳提取工艺条件(温度90 ℃、加10倍量水、提取2次、时间60 min)常压提取，合并提取液，减压浓缩，浓缩后样品每mL相当于原样品1.07 g，折合人体每天推荐用量为205 mg·kg-1。按相当于人体推荐量的10倍、30倍确定大鼠的低、高剂量组。另设煎煮液对照组，将规格样品加水浸泡1 h，100 ℃煮沸提取2次，第1次加入10倍量水，提取时间2 h，第2次加入8倍量水，提取时间1.5 h，提取液合并，减压浓缩，浓缩后样品1 mL相当于原样品1.14 g，人体每日推荐用量为193 mg·kg-1。按相当于人体推荐量的10倍设立煎煮液组。

2.2.2 试验过程 于屏障系统下以维持饲料饲喂大鼠，观察7 d。按体重随机分为空白对照组(给予维持饲料)和模型对照组(给予模型饲料)。模型对照组给予模型饲料16 d后，空白对照组和模型对照组大鼠不禁食，经眼内眦采血。采血后尽快分离血清，测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。根据TC水平将模型对照组随机分为模型对照组、丹参灵芝三七茶低剂量组、丹参灵芝三七茶高剂量组、煎煮液对照组，共4组。

受试样品用去离子水配制，每天1次灌胃给予大鼠，灌胃体积均按1 mL·(100 g)-1计，空白对照组与模型对照组给予相当体积去离子水，模型对照组及剂量组继续给予模型饲料，空白对照组继续给予维持饲料。定期称重并据此计算灌胃量，连续给予受试样品42 d。在试验前及试验结束时不禁食采血，分离血清，测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。

2.3 安全性毒理学试验 规格样品常压下温度90 ℃、加10倍量水提取2次，时间60 min，提取液合并，减压浓缩，浓缩后样品1 mL相当于原样品2.2 g，以此作为毒理试验样品。

2.3.1 急性经口毒性试验 检疫合格小鼠20只，雌雄各半，禁食禁水16 h后，一次经口灌胃给予受试样品20 mL·kg-1，观察14 d，记录小鼠中毒表现及死亡情况，试验结束后解剖动物并记录结果，根据急性毒性剂量分级标准评价受试样品毒性强弱。

2.3.2 遗传毒性试验

2.3.2.1 Ames试验 采用平板掺入法。按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)规定操作。试验菌为鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102，多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆作为体外代谢活化系统。

2.3.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 采用间隔24 h两次经口灌胃法进行试验。取体重25～30 g小鼠50只，雌雄各半，分5组，受试样品分为2.50、5.00、10.00 g·kg-1共3个剂量，40 mg·kg-1环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，末次给受试样品6 h后，处死动物，取胸骨做骨髓涂片。每只动物观察200个嗜多染红细胞(PCE)，并同时计数正染红细胞(NCE)，计算PCE/NCE比值。每只动物计数1 000个嗜多染红细胞，计算微核率。

2.3.2.3 小鼠精子畸形试验 体重25～35 g雄性小鼠25只，分为5组。受试样品剂量分别为2.50、5.00、10.00 g·kg-1。蒸馏水为阴性对照，40 mg·kg-1环磷酰胺为阳性对照，每天灌胃1次，连续5 d，末次给予受试样品后第30天处死动物，取附睾涂片，每只动物计数1 000个结构完整精子，计算畸变精子发生率。

2.3.3 大鼠30 d喂养试验 将SPF级大鼠80只随机分为低、中、高剂量组和对照组，20只/组，雌雄各半。低中高剂量分别相当于人体推荐量的25倍、50倍、100倍，高剂量组以原浓缩液灌胃，低、中剂量组经稀释制成，对照组给予蒸馏水，灌胃体积均为10 mL·kg-1，连续30 d。每周称一次体重，第31天禁食16 h后，称重，戊巴比妥钠麻醉，经腹主动脉取血，测定血常规和血生化指标，解剖动物并取材进行病理检查。

3 结果与分析

3.1 提取工艺筛选结果 丹参灵芝三七茶正交试验结果表明，影响浸膏得率的因素作用主次为提取次数>提取时间>加水量>提取温度，其中提取次数和提取时间对提取工艺影响最大，提取温度影响最小。提取次数2次、提取时间60 min、加水量10倍、提取温度90 ℃为最佳提取工艺条件。正交试验选择及结果见表1和表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计及结果

3.2 工艺验证试验结果 取一定量样品，按D2C2A1B3提取工艺条件进行3次提取工艺验证试验，浸膏得率平均值为20.92%，RSD为0.823%，表明正交试验筛选出的提取工艺稳定，验证结果见表3。

表3 工艺验证试验结果

3.3 辅助降血脂功能试验

3.3.1 丹参灵芝三七茶对大鼠体重的影响 各组大鼠生长良好，体重均表现逐渐增长趋势。空白对照组、受试样品低、高剂量组和煎煮液对照组的动物体重与模型对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。表明丹参灵芝三七茶对大鼠体重无显著影响，结果见表4。

表4 丹参灵芝三七茶对大鼠体重的影响

3.3.2 丹参灵芝三七茶对大鼠血脂的影响 空白对照组血清TG、TC和LDL-C含量均显著低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，表明高脂血症动物模型成立。在给予受试样品试验前，与模型对照组比较，各剂量组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量差异均无统计学意义(P>0.05)，结果见表5。

表5 试验前各组大鼠血清TC、HDL-C、TG、LDL-C含量比较

给予受试样品试验后，与模型对照组比较，样品高剂量组及煎煮液对照组大鼠血清TC、LDL-C和TG含量均显著下降(P<0.05)。各剂量组血清HDL-C含量无统计学差异(P>0.05)，但有升高趋势。空白对照组血清TG、TC和LDL-C含量均显著低于模型对照组(P<0.01)。表明不同提取方式制备的受试样品辅助降血脂功能动物试验结果阳性，结果见表6。

表6 试验后各组大鼠血清TC、HDL-C、TG、LDL-C含量比较

注：与模型对照组比较，**P<0.01

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.4 安全性毒理学试验

3.4.1 急性经口毒性试验 以动物最大灌胃体积20 mL·kg-1，一次性灌胃给予受试样品浓缩液后，各试验动物未见明显活动异常及中毒症状，14 d内动物无死亡。该剂量相当于原样品44 g·kg-1，是人体推荐日用量0.22 g·kg-1的200倍。依据急性毒性分级标准，丹参灵芝三七茶属无毒级。

3.4.2 遗传毒性试验 Ames试验结果显示，对TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，加与不加S-9，样品各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数2倍，且无剂量-效应关系。

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果显示，受试样品各剂量组微核率与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)，环磷酰胺组与阴性对照组比较差异显著(P<0.01)，受试样品各剂量组的PCE/NCE比值均不低于阴性对照组的20%，因此，样品对小鼠骨髓细胞未见明显毒性。

小鼠精子畸形试验结果显示，受试样品各剂量组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)，环磷酰胺组与阴性对照组比较有显著差异(P<0.01)。

3.4.3 大鼠30 d喂养试验 试验期间动物活动、摄食和排便等一般状况未见明显差异；与对照组比较，各剂量组雌、雄大鼠摄食量、体重增重和食物利用率无明显差异，主要脏器的重量及脏体比无明显差异，血常规指标、血生化指标无明显差异；解剖观察各剂量组动物，未见明显脏器的肉眼病变和病理组织学改变。

4 讨论与结论

丹参灵芝三七茶是采用药食同源原料丹参、灵芝、三七与红茶按照中医古方制成的袋泡茶，以期寻求通过简单的冲泡方式实现辅助降低血脂功效的保健功能食品。丹参又名赤参、紫丹参、活血根等，常用于治疗冠心病、心绞痛、脑梗死、高血脂等症。丹参中含有的主要水溶性成分为丹酚酸B、丹酚酸A、丹参素、原儿茶醛等酚酸类成分[8]，研究显示丹参水提取物灌服大鼠后，血清中出现丹参素钠吸收峰，表明丹参素可经胃肠道吸收[9]，其吸收入血后能通过抑制内源性胆固醇合成和明显增加肝细胞胆固醇7α-羟化酶(CYP7A) mRNA表达，促进胆固醇转化为胆汁酸，从而降低血浆中胆固醇含量。另外，丹参素可降低血浆总同型半胱氨酸水平，维持氧化还原平衡，降低高脂血症的发病风险[10-11]。三七可以使血清中三酰甘油和总胆固醇水平显著降低，减少主动脉内膜脂质斑块的同时减轻动脉壁受损情况[12]，可明显改善TC、TG、LDL-C和HDL-C[13]。近代医学研究发现，灵芝能降低患心血管疾病的风险，预防多种疾病模型的心脏损害，具有改善冠状动脉血液循环、降低心肌耗氧量和耗糖量、增强心肌对机体缺氧的耐受力等作用[14-15]。灵芝能明显降低血清TC、TG、LDL-C及升高HDL-C，还可降压、软化血管、降低血液黏度等抗动脉硬化的作用[16-17]。红茶为六大茶类之一，为全发酵茶，含有茶多酚、茶黄素、黄酮等成分，这些成分都具有调节血脂的功效[18]。本文参照国食药监保化〔2012〕107号《关于印发抗氧化功能评价方法等9个保健功能评价方法的通知》附件6“辅助降低血脂功能评价方法”，用高脂饲料建立大鼠混合型高脂血症动物模型，研究丹参灵芝三七茶对大鼠血脂水平的影响。结果显示，样品高剂量组及煎煮液能显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG和LDL-C含量，同时对血清HDL-C含量有升高趋势。表明丹参灵芝三七茶冲泡服用和煎煮服用均具有降血脂作用。采用急性经口毒性试验、Ames 试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和30 d喂养试验对丹参灵芝三七茶进行安全性毒理学评价，结果显示该受试样品属无毒级，遗传毒性试验结果为阴性，30 d喂养试验未发现有意义的病理性损伤。根据《食品安全性毒理学评价程序》 GB 15193.1-2014，丹参灵芝三七茶未见明显毒性作用，表明该产品安全无毒副作用。