米力农生产工艺中新化合物的形成与环化机制及其结构推测

唐斌，徐伟，丛艳，权晓丹*，赵学清*

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.黑龙江三元阳普医药有限公司，黑龙江 哈尔滨 150070)

在制药工业历史上，美国从1966年至1984年、日本从1971年至1998年完成了已上市仿制药的一致性评价[1]。中国为了提高仿制药的质量与安全性，2015以来，从国家层面上强烈推动了开展仿制药的一致性评价工作[2]。

米力农(见图1)的注射剂于1986年在美国上市，用于治疗心脏衰竭，2003年其仿制药在中国上市。此药物需重新进行一致性评价，这涉及对米力农的原料药进行全面的质量研究，建立严格的质控及质量标准等。

图1 米力农的工业化路线

在对合成米力农的主要原料及中间体2～5进行结构确证时，我们惊讶地发现工艺中所谓的米力农粗品，其中米力农含量仅25%，主要为一新化合物2，进一步研究揭示了此新结构的形成及环化成米力农的机制，而相关文献中未有报道[3-4]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 核磁共振仪AVANCE Ⅲ 500(德国Bruker公司)；红外光谱仪Nicolet is5(美国Thermo Fisher Scientific公司)；高分辨质谱仪Agilent 6520(德国Bruker公司)；高效液相色谱仪LC-2010A HT(日本Shimadzu公司)。

1.2 材料 无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)；甲醇钠(国药集团化学试剂有限公司)；冰醋酸[阿拉丁试剂(上海)有限公司]；原料4、丙二腈及用于测定1H-NMR的“米力农粗品”(哈尔滨三联药业股份有限公司)。

1.3 方法 分析方法参照《中国药典》2020年版(二部)中米力农有关物质的测定方法。

2 试验内容

图2 新化合物2的高分辨质谱

图3 新配制2的溶液即测HPLC

图4 样品2溶液放置4 h后的 HPLC

2.2 米力农1的制备 将上述所谓“米力农粗品”5.81 g溶于含甲醇钠2.68 g(50.0 mmol)的甲醇(48 mL)溶液中，加热回流30 min，析出大量固体，静置冷却至室温再冰水冷却后[反应液中反应物料的HPLC(见图5)，归一化方法，米力农Rt5.82 min，95.16%，[M+1]+212.081 6(见图6)，另一未知副产物杂质Rt4.85 min，4.84%，[M+1]+131.081 5(见图7)，计算机给出C6H4N4，可能为丙二腈两分子缩合物)，离心、并用冷无水乙醇约10 mL 洗涤滤饼(1的钠盐)]，得滤饼，白色片状晶体，纯度为99.21%；1H-NMR(CD3OD，500 MHz)：δ 8.47(d，J=6.8 Hz，2H)，7.70(s，1H)，7.35(d，J=6.8 Hz，2H)，2.31(s，3H)，与米力农比较，钠盐使得一个H的化学位移从δ 8.19移至高场δ 7.70。

图5 环合反应物料米力农及未知杂质的HPLC

图6 环合反应物料的LC-HRMS中米力农峰

图7 环合反应物料的LC-HRMS中未知副产物峰

滤饼加入纯化水60 mL，搅拌使其溶解，再向溶液中加入少量活性炭，室温下搅拌30 min，滤除活性炭、水洗。以冰乙酸调节pH至6～7，冷却至15～10 ℃，抽滤，以少量纯化水、无水乙醇洗涤后，于50～60 ℃真空干燥得1，类白色粉末3.08 g，收率53%，纯度为99.86%。1H-NMR(DMSO-d6)：δ 8.63(d，J=6.6 Hz，2H)，8.19(s，1H)，7.44(d，J=6.6 Hz，2H)，2.33(s，3H)。再以乙醇精制得白色片状结晶2.78 g，收率90%，纯度为99.89%。

3 米力农中间体的结构解析及其形成与环化的机制推测

3.1 新化合物2的结构测定 为阐明新化合物2的结构，需制备更高纯度的2：由于在溶液状态中2很不稳定，因此中间体4与丙二腈的反应，以温和的条件(0～5 ℃)代替回流的生产工艺条件，一旦有少许的红色固体形成，即快速抽滤、洗涤、干燥得到2，根据氢谱的积分，2的纯度可达95%(2与1的比例可达19∶1)。

作为无定型粉末，在溶液状态下2很容易转变成1，因此无法通过重结晶获得可用于X-衍射测定的晶体；此外，在2的样品溶于DMSO-d6后，需立即测定NMR图谱，即使如此，仍有少量的2(约5%)转变成1。测定1H-NMR图谱的样品直接来自反应液，其谱图上显示含有乙醇的H及冰醋酸的H、及少量丙二腈的H。这些杂质影响了NMR(13C-NMR、NOSEY、HSQC、HMBC)的解析，需要小心剔除与米力农、乙醇及冰醋酸的相关H及C峰。

仅根据结构测试图谱数据，还无法推断出2的结构，只能先根据化学反应原理推断2的形成以及2环合成米力农的可能路径，将推测出2的结构判别其是否符合结构测试数据。

3.2 新化合物2的形成历程 该米力农合成方法的相关文献中并未提及此新结构2。β-二羰基化合物或β功能化的α,β-不饱和酮，与丙二腈或有关化合物已被广泛应用于2(1H)-吡啶酮以及其他杂环化合物的合成[5-11]。同时，有关反应的机制也得到广泛深入的研究与阐明。结合各种结构测试数据，我们推测2的形成过程如下：

在醋酸的存在下，4与丙二腈进行Aldol加成反应形成6，再酸性消除一分子乙醇，并发生双键转移得到醛8，8再继续与一分子丙二腈进行Aldol加成形成2(见图8)。由于2在反应介质中溶解度很差，一旦形成就沉淀下来。

图8 新化合物2的形成历程

此中试“米力农粗品”中，核磁共振图谱中2与1的摩尔比例为75∶25，中间产物2消耗了一分子丙二腈，这也解释了为何丙二腈单耗1.77 eq时，“米力农粗品”的收率最高，因为2的结构多消耗了大约0.7 eq的丙二腈。

3.3 不同条件下新化合物2的环合机制

3.3.1 在酸性及近中性条件下 固体状态的2相对稳定，但有趣的是在溶液状态下，无论是酸性、中性，还是碱性条件下，2都容易转变成1。在不同酸碱条件下，转变速度差异很大，因此我们推测在不同的条件下，转化机制可能不同。

如在制备时的酸性溶液中(见图9)，2快速转变成1，前提是其处于溶解状态；在DMSO-d6的近中性溶液中(测定核磁时)，24 h后转变完全转化成1；HPLC分析在pH 4～5的洗脱液乙腈-水中，大约8 h后，2完全转变1。

图9 酸性与近中性条件下2的环合历程

2质子化后的9在脱水的同时，双键位移与腈基的N进攻双键的一个碳，形成六元环10，10捕获一分子水形成11，化学键位移消除一分子丙二腈，继而形成稳定的1。

3.3.2 在碱性条件下 2在碱性条件下，形成钠盐12，化学键位移的同时消除OH，得到13。氰基N进行Michael加成，并捕获一分子碱形成14，经质子转移形成15，最后化学键位移，消除一分子丙二腈的钠盐，得到稳定结构的1(见图10)。由于有过量的碱存在，得到是1的钠盐，最终需酸化得到1。2环合时释放出一分子的丙二腈，这也解释了混合物环合时甲醇钠消耗1.80 eq为最佳。

图10 碱性条件下2的环合历程

3.4 新化合物2结构测试数据的解析 分析由反应历程推测的结构2是否与结构测试结果一致：HRMS：[M+1]+278.104 5(见图2)，计算机给出的分子式为C15H11N5O(98%的可能性)，其比米力农多C3H2N2，与丙二腈(NCCH2CN)分子式一致。核磁共振样品放置24 h后再测，则样品转化为米力农，同时释放了一分子丙二腈。但是在甲醇钠溶液中2转化成米力农的反应中，反应物料的HPLC(见图5)检测(归一化法)，除了米力农[LC-HRMS：Rt 5.82 min，95.16%，[M+1]+212.081 6(见图6)]，另有一副产物[LC-HRMS：Rt 4.85 min，4.84%，[M+1]+131.081 5(见图7)]，计算机给出的分子式C6H4N4，推测因为在强碱性的加热条件下，环合反应释放得到丙二腈(C3H2N2)的两分子缩合物(见图11)，这也是Aldol加成反应。为验证这一转化，采用丙二腈与甲醇钠溶液，加热处理，得到了同样的缩合物。分析IR数据，3 403 cm-1为OH伸缩振动，对比米力农，2中2 186.9 cm-1峰显得超强，为多个C≡N键的伸缩振动，1 655 cm-1峰极弱，可能是少量米力农杂质的酰胺C=O伸缩振动。

图11 碱性条件下丙二腈的双分子缩合

1H-NMR谱图(见图12)上除了吡啶环的4个H和CH3的H外，仅有两个H峰：δ 6.97(s，2H)和(δ 7.91，s，H)，处于如此低场，应为烯烃上或类似烯烃的H。而碳1、4、5上的H化学位移，通常应在4～5之间。此外，13C-NMR[HSQC(见表1)及HMBC(见图13及表1)]谱图上δ为109.08、146.35，与其对应的碳依次为2、4位的碳，而δ 166.32为3位碳，与4位H(δ 7.91，s，1H)、CH3的H(δ 2.27，s，3H)相关。δ 88.00碳与1、5位H(δ 6.97，s，2H)相关，而4、3、1和5位碳与氢δ为何在如此低场？类似结构的文献[5]中提出了一种设想：分子中双键及孤对电子离域形成共轭的六元环(见图14)，此时就可以解释为何这些H与C在如此低场。

表1 新化合物2的NMR数据(DMSO-d6)

图12 新化合物2的1H-NMR图谱

图13 新化合物2的HMBC局部图

图14 新化合物2的离域形态

4 总结

对米力农原料药制造过程进行再评价时，发现原“米力农粗品”是一个新结构化合物与米力农的混合物。通过降低反应温度，制备了较纯的新化合物，并进行了各种结构测试。根据化学反应原理推测新化合物的形成、各种条件(酸性、中性或碱性)下环合形成米力农的历程，同时结合结构测试数据，最后推测其可能结构式为醚化的α,β-不饱和酮原料与丙二腈进行两次Aldol加成的产物。