基于UPLC-Q-TOF-MS的茅苍术入血成分及其抗溃疡的网络药理学机制研究

于丹，张慧

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

茅苍术是指菊科植物茅苍术(RhizomaAreactylodisLanceae)的干燥根茎；据《中国药典》2020年版记载：其味微甘、辛、苦，性温；归脾、胃、肝经；具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效；用于治疗湿阻中焦、脘腹胀满、泄泻、水肿等[1]。现代药理作用表明茅苍术具有抗溃疡，抑制胃酸的分泌，控制胃组织中的炎性细胞因子过度表达，促进胃黏膜的修复和增加胃黏膜血流量等作用，临床经常用于抗胃溃疡等消化道系统疾病[2-3]。

根据现代医学研究表明：中药在治疗疾病过程中，具有多成分作用于多靶点，同时调控多通路的特点。而目前关于茅苍术治疗胃溃疡的机制研究，主要基于Okabe法以及HE染色法观察胃组织病理的变化；并通过酶联免疫吸附法检测血清及胃组织内胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、炎症因子白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量等[4-5]。但此机制研究方法无法具体体现茅苍术何种入血成分发挥作用；而现有针对茅苍术入血成分质谱分析实验，又基本旨在找到其炮制品与生品入血成分的区别[6-7]，并从未将入血成分与靶点和通路联系起来；鉴于上述内容，本研究通过超高效液相色谱与四级杆飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)对苍术的入血成分进行定性分析，并借助网络药理学，基于系统生物学理论，通过网络的分析、筛选等技术揭示了“药物-靶点-疾病”之间复杂的网络关系，打破了文献相关单一的研究模式[8]，对苍术治疗胃溃疡的多成分、多靶点、多途径的分子作用机制进行探索，找到其主要起效成分、主要作用靶点和通路，为推进临床合理用药提供一定的理论基础和依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS；KQ250DB型超声波清洗器；FD-1A-55冷冻干燥机；高速离心机；TGL-16B低速台式离心机。

1.2 药材与试剂 茅苍术经辽宁中医药大学药学院张慧教授鉴定为菊科植物茅苍术(RhizomaAreactylodisLanceae)的干燥根茎；甲醇(质谱纯，德国默克集团)；乙腈(质谱级，Fisher)；纯净水(娃哈哈)；甲酸(德国默克股份两合公司)；甲醇(分析纯，科密欧)。

1.3 动物 健康清洁级SD大鼠，雄性，体重170～190 g，辽宁长生生物提供。

2 方法

2.1 大鼠体内入血成分分析

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18色谱柱(2.1 mm×50 mm)；A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液作为流动相(0～20 min，5%A～100%A)，梯度洗脱，柱温35 ℃，流速0.3 mL·min-1，进样量5 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)使用负离子模式；干燥气体流速11 L·min-1；毛细管电压4 V；干燥气体温度350 ℃；雾化器气压35 psi；毛细管电压3.5 kV;碎片电压380 V；质谱采集范围从100～3 000 m/z。

2.1.3 供试品溶液的制备 取苍术粉末8 g，加甲醇1 L，超声提取1 h，超声结束后过滤，滤液经过减压浓缩成浸膏，加水溶解冷冻放置24 h后冷冻干燥，既得。

2.1.4 血清样品的采集 取大鼠12只(SD级)，共分为两组(每组6只)，分别为空白组和苍术组。以剂量为1 g·kg-1(药材)灌胃给药，空白组灌胃同等剂量的生理盐水。分别在给药后30 min、60 min进行眼眶静脉取血，4 ℃下静置30 min后，3 000 r·min-1低速离心15 min，取上清液1 mL，加4倍量的乙腈，迅速涡旋3 min，10 000 r·min-1高速离心10 min，取上清40 ℃氮气吹干，加100 μL的甲醇，10 000 r·min-1高速离心5 min,过滤得到血清样品。

2.1.5 大鼠血清入血成分分析 分析一级图谱和二级图谱碎片离子峰并结合文献报道，对色谱峰进行定性鉴别，对比苍术药材和含药血清的保留时间，确定入血成分。

2.2 网络药理学分析抗胃溃疡作用机制

2.2.1 入血成分靶点预测 采用TCMSP数据库和Swiss Target Prediction(http://www.swis-s target-prediction.ch/predic-t.php)对鉴定的茅苍术入血成分进行蛋白靶标获取，然后利用UniProt数据库中UniProt KB检索功能对蛋白靶标进行逐一检索，对蛋白靶标进行一一对应的基因名称转换，获取苍术入血成分的作用靶点。

2.2.2 胃溃疡作用靶点获取 以“gastric ulcer”为检索词，在Gene Cards数据(http://www-genecards.org/)进行检索，获取胃溃疡作用靶点。利用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.e-s/tools/venny/index.html)在线工具，获得苍术与胃溃疡共同作用靶点，即是苍术治疗胃溃疡的作用靶点。

2.2.3 靶点蛋白关系网络构建 将共同作用靶点输入到String数据库(https://string-db.org/)“Multipleproteins”检索框中，蛋白种类设置为“homosapiens”，其他参数均为默认设置，获取蛋白质相互作用关系，并通过Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。

2.2.4 GO和KEGG富集分析 利用Matascape(https://metascape.org/gp/index.html)对共同作用靶点分别进行生物过程、细胞组分和分子功能的GO分析和KEGG富集分析。

2.2.5 分子对接验证 选择PPI网络中连接度值最高的5个靶点，认为这5个靶点是药物治疗胃溃疡疾病的核心靶点基因。通过TCMSP数据库得到入血成分的mol2化学结构，使用PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获取找到相应的靶点蛋白，再利用Pymol软件除去靶点蛋白上的小分子，最后通过Auto Dock1.5.6软件进行分子对接。

3 结果

3.1 大鼠体内入血成分 分析一级图谱和二级图谱碎片离子峰并结合文献报道，对色谱峰进行定性鉴别，通过对比含药血清(见图1)、药材(见图2)、空白血清(见图3)中各成分的保留时间一级谱图信息，以及其精确分子量，碎片离子峰，最终鉴别出9个成分，分别是汉黄芩苷、苍术酮、白术内酯 Ⅰ、白术内 Ⅱ、白术 Ⅲ、β-桉叶醇、苍术素、棕榈酸、酪氨酸。茅苍术的负离子模式下的分子离子峰鉴别见表1。

表1 茅苍术分子离子峰鉴别(负离子)

图1 含药血清UPLC-Q-TOF-MS/MS总离子流图

图2 茅苍术药材UPLC-Q-TOF-MS/MS总离子流图

图3 空白血清UPLC-Q-TOF-MS/MS总离子流图

3.2 苍术入血成分靶点的获取以及网络图的构建 通过TCMSP数据库对苍术入血成分的靶点进行预测，未在TCMSP找到靶点的成分，通过Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测。将入血成分和靶点输入Cytoscape软件形成网络图(见图4)。茅苍术入血成分的MOL ID以及对应的靶点见表2。

图4 入血成分-靶点网络图

表2 茅苍术入血成分及其靶点

3.3 交集靶点及相互作用网络构建 利用在线Venn2.1分析工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获得入血成分的靶点和胃溃疡疾病靶点的交集，并绘制Venn图(见图5)。将交集靶点输入string(http://string-db.org/)网站，“mediumcofidence”大于0.4，隐藏一个游离靶点，其余为默认值。将其数据文件导入Cytoscape软件，最终得到其PPI网络图。PPI网络中共有19个节点(去除1个独立节点)，70条边，degree值越大节点越大(见图6)。

图5 入血成分靶点-胃溃疡疾病靶点韦恩图

图6 茅苍术与胃溃疡交集靶点的PPI网络图

3.4 通路富集分析结果 利用matascape(https://metascape.org/gp/index.html)对共同作用靶点分别进行细胞组分(CC)、生物过程(BP)和分子功能(MF)GO分析(见图7)，主要涉及蛋白酶结合(protease binding)、生长因子受体结合(growth factor receptor binding)、蛋白质二聚化活性(protein homodimerization activity)、受伤反应(response to wounding)、多细胞机体稳态(multicellular organismal homeostasis)、细胞黏附的调节(regulation of cell adhesion)、膜筏(membrane raft)、 顶端质膜(apical plasma membrane)和KEGG富集分析(见图8)，包括P13K-AKT信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、鞘脂信号通路(Sphingolipid signaling pathway)、结核(Tuberculosis)。

图7 GO富集分析

图8 KEGG富集分析

3.5 分子对接结果 采用AutoDock软件对“成分-靶点”中相关度前5的主要入血成分与PPI网络中自由度较高的前5个重要靶点进行分子对接分子对接显示苍术酮、白术内酯Ⅰ、苍术素与5个靶点的结合自由能均小于-4 kcal·mol-1(见表3)。

表3 活性成分-靶点结合能

4 讨论

现有研究表明胃溃疡是由于胃黏膜上皮细胞出现炎症反应、氧化应激、炎性反应和坏死性病变，进而导致胃溃疡[9-10]。本实验采UPLC-Q-TOF-MS方法，共鉴别出茅苍术9个原型入血成分，分别为苍术酮、苍术素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、β-桉叶醇、酪氨酸、棕榈酸。包括烯炔类、倍半萜类、酯类成分、有机酸等；通过网络药理学探索出9个入血成分抗胃溃疡的作用机制，结果显示，其中有苍术酮、苍术素、白术内酯Ⅰ是治疗胃溃疡的有效成分，其主要是通过作用于TNF、IL-6、VEGFA、NOS3、IL-10靶点进而对AGE-RAGE、PI3K-Akt等信号通络进行调控，从而发挥抗溃疡的作用。其中，根据现有文献发现炎症反应最初是由TNF参与的，再通过减少IL-6、IL-10炎症因子的释放进而控制炎症反应[11]，VEGFA 是VEGF生长因子家族的成员，能促进血管内皮细胞增殖分化与迁移功能，茅苍术通过此靶点加速溃疡的愈合[12]。此外，血清中的NOS与胃黏膜的保护作用息息相关，如含量较低，则胃黏膜受损较严重[13]。因此，茅苍术治疗胃溃疡可能通过调节IEC-6、TNF、IEC-10、VEGFA、NOS3来治疗胃溃疡。而主要发挥作用的有效成分是苍术酮、白术内酯Ⅰ、苍术素。

本研究采用网络药理学的分析方法，筛选苍术的有效成分和可能作用得靶点，构建网络图进行深入分析，并进一步预测苍术治疗胃溃疡的关键调控靶点与相关通路，体现苍术多成分、多靶点、多途径的治疗特点，为接下来对其进行实验验证提供理论依据。