基于指纹图谱及多成分含量测定快速筛查苍术混伪品*

彭新航，肖凌，费毅琴，聂晶

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.湖北省药品监督检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，湖北省药品质量检测与控制技术研究中心，武汉 430075)

苍术为菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎[1]，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效，此外还具有抗炎和抗肿瘤的作用[2-3]。苍术属(AtractylodesDC.)药用植物除了《中华人民共和国药典》收载的2个品种[4]，还包括东北地区习用药材关苍术(A.japonica)和朝鲜苍术(A.coreana)[5]。药用苍术属植物一共有4种，北苍术主要分布在内蒙古、河北、黑龙江、辽宁和吉林等地[4]，是目前市场的主流品种；茅苍术分布在江苏、安徽等地[6]；而关苍术收载于《黑龙江省中药材标准》2001年版，市场流通较为普遍；朝鲜苍术收载于《辽宁省中药材标准》2019年版，产量有限，市场基本未见流通。

笔者通过调研发现，目前苍术药材市场流通以北苍术与关苍术为主，关苍术价格与北苍术价格差异较大，药材性状上两者较为相近，特别是切制成饮片或麸炒后，性状外观更加难以分辨，故出现伪充、掺杂或混卖的现象，目前笔者尚未见文献报道相应的检测方法。因此，本实验建立苍术高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)指纹图谱，并深入探讨正品苍术与关苍术中3种特征成分含量差异，以期为苍术药材饮片的质量监管提供技术支持。

1 仪器与材料

1.1仪器 Agilent 1260 Series高效液相色谱仪；Waters XEVO Q-TOF- MS四级杆飞行时间质谱仪；XP205、 XP204型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，感量：0.1 mg]；LC-350A超声波仪(济宁市中区鲁超仪器厂)。

1.2材料 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Kinetex XB-C18100A(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，水为一级纯化水，其他试剂均为分析纯。

苍术素对照品(批号：111924-201806，含量：以99.5%计，中国食品药品检定研究院)；β-桉叶醇对照品(CAS号：473-15-4，含量：98.8%，PANPHY)；苍术酮对照品(CAS号：6989-21-5，含量：98.03%，PANPHY)。

58批苍术药材采自全国各苍术药材主产地和道地产地，经湖北省药品监督检验研究院肖凌副主任药师鉴定为菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.或关苍术AtractylodesjaponicaKoidz.ex Kitam.的干燥根茎。筛查的200批苍术饮片来自国家药品监督管理局国家药品抽检样品。

2 方法与结果

2.1实验方法

2.1.1对照品溶液的制备 分别取β-桉叶醇、苍术素、苍术酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升各含50，50，30 μg的溶液，即得。

2.1.2供试品溶液的制备 取本品粉末[过孔径(355±13)μm(三号筛)]0.5 g，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3色谱条件 采用Agilent ZORBAX SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，柱温30 ℃，流速为1.0 mL·min-1，进样量10 μL，流动相为0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，进行梯度洗脱：0～50 min，40%→95%B；50～52 min，95%→40%B；52～55 min，40%B。检测波长为203 nm，理论板数按β-桉叶醇峰计算应不低于2500。

2.2指纹图谱鉴别方法的建立

2.2.1苍术对照指纹图谱的建立 取苍术药材(北苍术41批、茅苍术8批、关苍术9批)58批，按“2.1.2”项制备供试品溶液并进样测定，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)”进行模式识别，选用平均数生成对照图谱的方法，时间窗宽度设置为0.2，分别得出北苍术、茅苍术和关苍术的对照指纹图谱，见图1-3。

4.TDDA；5.TDEYA；6.β-桉叶醇；7.苍术素；8.苍术酮。

4.TDDA；5.TDEYA；6.β-桉叶醇；7.苍术素；8.苍术酮。

2.白术内酯Ⅲ；5.TDDA；6.TDEYA；7.芹烷二烯酮；8.苍术酮。

2.2.2指纹图谱特征峰的归属 对苍术药材指纹图谱进行数据处理，共标定9个主要峰，通过与“2.1.1”项对照品溶液进行比对，指认3个特征峰，北苍术和茅苍术中，峰6为β-桉叶醇，峰7为苍术素，峰8为苍术酮；关苍术中，峰8为苍术酮。为了更加全面辨识苍术指纹图谱特征峰，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对其余特征峰进行解析。

①UPLC-Q-TOF-MS/MS条件。色谱柱Kinetex XB-C18100A(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱温30 ℃，流速0.2 mL·min-1，进样量5 μL，以0.1%甲酸溶液为流动相为A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱：0～6 min，40%→56.5%B；6～20 min，56.5%→60%B；20～22 min，60%→100%B；22～25 min，100%B；二极管阵列检测器，进样量5 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式，雾化气氮气(N2)体积流量为800 L·h-1，脱溶剂气温度为350 ℃，离子源温度为100 ℃，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压40 V，补偿电压80 V。MSE扫描模式检测，碰撞能量(20～30 V，MS扫描模式检测，碰撞能量为20～22 V，9～11 V，气帘气体积流量为50 L·h-1，扫描范围m/z50～1200。亮氨酸-脑啡肽(m/z：556.277 1)作为外标进行质量实时校正，体积流量设为5 μL·min-1。

②指纹图谱特征峰的解析。通过二级碎片离子信息，结合标准品液相数据和参考文献的相关质谱数据对苍术指纹图谱中的9个特征峰进行解析。归属北苍术及茅苍术中，峰4为(4E，6E，12E)-tetradecatriene-8，10-diyne-1，3-diol-diacetate(TDDA)，峰5为(6E，12E)-tetradecadecatriene-8，10-diyne-1，3-diol-diacetate(TDEYA)，峰6为β-桉叶醇，峰7为苍术素，峰8为苍术酮；关苍术中，峰2为白术内酯Ⅲ[7-8]，峰5为TDDA，峰6为TDEYA，峰7为芹烷二烯酮[8-9]，峰8为苍术酮。

由于北苍术及茅苍术中峰4与峰5与关苍术中峰5与峰6，质谱信息与紫外信息均相同，但峰响应值有较大差异。对此两峰进行详细解析：正品苍术(北苍术、茅苍术)峰4在波长为249，265，297，315，336 nm处附近有多个吸收带，且在各个吸收带的紫外吸收强度接近，查阅文献[10]可知，其为具有单烯-二炔-二烯发色团类成分的紫外特征图谱。

在正离子模式下，正品苍术(北苍术、茅苍术)峰4的分子离子峰为m/z：323.1255[M+Na]+，分子量为300，分子式：C18H20O4。碎片离子：m/z263.1052[M+Na-C2H4O3]+、m/z181.1016[M+H-C4H8O4]+、m/z165.0703[M+H-C5H12O4]+，结合参考文献鉴定为：(4E，6E，12E)-tetradecatriene-8，10-diyne-1，3-diol-diacetate(TDDA)[10]。

关苍术峰5在波长为276，293，312 nm处附近有多个吸收带，查阅文献[10]可知，其为具有单烯-二炔-单烯发色团的紫外特征图谱。

在正离子模式下，关苍术峰6分子离子峰为m/z：325.1408[M+Na]+，分子量302，分子式：C18H22O4。碎片离子：265.1198[M+Na-CH3COOH]+、243.1369[M+H-CH3COOH]+，结合参考文献鉴定为：(6E，12E)-tetradecadecatriene-8，10-diyne-1，3-diol-diacetate(TDEYA)[10]。

2.2.3重复性实验 取6份苍术样品粉末(过三号筛)，制备供试品溶液6份，进样分析，计算色谱图上9个峰的峰面积和保留时间，并计算6次测定结果的RSD值。结果9个色谱峰的峰面积和保留时间RSD值均<3.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.4精密度实验 取同一份供试品溶液，按“2.1.3”项色谱条件连续进样测定6次，计算9个特征峰的峰面积和保留时间，并计算6次测定结果的RSD值，结果9个共有峰的峰面积和保留时间的RSD均<3.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.5稳定性实验 取同一份苍术药材供试品溶液，分别在制备后0，2，5，8，13，15 h进样，计算9个峰的峰面积和保留时间，结果RSD均<3.0%，表明供试品溶液在15 h内稳定性良好。

2.2.6耐用性实验 取同一供试品溶液，分别使用Agilent ZORBAX SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)2种不同的色谱柱进行检测，记录色谱图，以峰7为参考峰，计算9个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果不同的色谱柱对测定结果无影响。

通过苍术正品和混伪品指纹图谱对比发现，图1～3中，苍术正品中TDDA(峰4)、β-桉叶醇(峰6)和苍术素(峰7)的峰相对较高，苍术酮(峰8)、TDEYA(峰5)较小；苍术混伪品(关苍术)中TDEYA(峰6)、芹烷二烯酮(峰7)和苍术酮(峰8)的峰相对较高，而苍术素和β-桉叶醇的含量极低。总体看来，TDDA和TDEYA可作为鉴别苍术正品与苍术混伪品的关键，也是造成苍术正品与苍术混伪品的指纹图谱相似度差异的来源之一。

2.2.7指纹图谱相似度评价 供试品指纹图谱中应分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与北苍术或茅苍术对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。

2.33种有效成分的含量测定

2.3.1系统适用性实验 取“2.1.1”项对照品溶液，按“2.1.3”项色谱条件进样，记录色谱图，见图4。出峰时间顺序分别是β-桉叶醇(26.764 min)、苍术素(29.396 min)、苍术酮(41.460 min)，各峰之间分离度均>2，理论板数按β-桉叶醇峰计算应不低于2500。

A.混合对照品；B.供试品；1.β-桉叶醇；2.苍术素；3.苍术酮。

2.3.2线性关系考察 精密称取β-桉叶醇、苍术素、苍术酮适量，加甲醇配制成混合对照品溶液后，按“2.1.3”项色谱条件分别进样1，2，5，10，15，20 μL，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标进行线性回归，得到β-桉叶醇回归方程Y=1 475.284X+28.685(R2=0.999 9)，苍术素回归方程Y=6 884.900X+1.822(R2=1.000 0)，苍术酮回归方程Y=1 729.919X+0.829(R2=1.000 0)，β-桉叶醇、苍术素、苍术酮进样量分别在0.431 0～8.615 0，0.049 0～0.979 1，0.116 3～2.326 1 μg范围内与峰面积之间线性关系良好。

2.3.3重复性实验 精密称取苍术粉末(过三号筛)0.50 g共6份，按“2.1.2”项方法配制成供试品溶液，按“2.1.3”项色谱条件进样测定，计算β-桉叶醇、苍术素、苍术酮的平均含量分别为3.35%，0.28%，0.21%，RSD分别为1.88%，1.87%，2.21%，表明该方法重复性良好。

2.3.4准确度实验 精密称取苍术粉末0.13 g，精密加入混合对照品溶液(β-桉叶醇0.430 8 mg·mL-1、苍术素0.048 97 mg·mL-1、苍术酮0.116 3 mg·mL-1)3 mL，平行称定6份，按“2.1.2”项方法制备成供试品溶液，按“2.1.3”项色谱条件进行测定，计算β-桉叶醇、苍术素、苍术酮的加样回收率及RSD，结果见表1，β-桉叶醇、苍术素、苍术酮的平均加样回收率分别为92.06%，91.67%，92.72%，RSD分别为0.90%，1.21%，1.54%，均<3.0%，表明该分析方法准确度良好。

表1 苍术中3种成分加样回收率实验结果

2.3.5稳定性实验 取“2.1.2”项下供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分别在0，2，5，8，13，15 h内进样10 μL，测得β-桉叶醇、苍术素、苍术酮的RSD为0.27%，0.35%，0.76%，表明供试品溶液在15 h内稳定性良好。

2.3.63种有效成分的含量测定 取58批苍术药材，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，平行制备2份，按“2.1.3”项色谱条件进样分析，记录峰面积，按回归方程计算3种成分的含量，结果见表2。

2.3.7不同品种苍术含量测定规律 表2显示3种有效成分在不同品种苍术中含量差异显著，苍术酮/苍术素的含量比值差异尤为明显，其中关苍术中此含量比值高达228.98，而正品苍术(北苍术、茅苍术)中此比值不到2。因此，当苍术酮/苍术素的含量比值>200可判断为关苍术，比值<2可判断为北苍术或茅苍术，比值在2～200则疑似为苍术正品中掺伪关苍术。

表2 不同品种苍术药材中3种成分含量范围

2.4苍术混伪品筛查方法的应用 200批国家抽检样品，采用“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1.3”项条件进样，先以峰6、峰7、峰8的出峰情况初步判断品种来源，继之与相应品种对照指纹图谱进行比对，再以9个Marker峰匹配计算相似度。通过指纹图谱和含量测定结果判断样品真伪。

基于指纹图谱结果，有192批样品判断为苍术正品，其中与茅苍术对照图谱比较，相似度>0.90的有10批，判断为茅苍术。

与北苍术对照图谱比较，相似度>0.90的182批，判断为北苍术；8批样品指纹图谱相似度与北苍术和茅苍术相比均<0.9，判断为苍术混伪品，主要差异来源于TDEYA和苍术酮色谱峰的异常偏高。8批苍术混伪品中，1#样品与北苍术对照指纹图谱比较相似度为0.218，但与关苍术对照图谱比较相似度为0.986，判断为关苍术，见图5。有4批指纹图谱相似度<0.8，见图6；有3批指纹图谱相似度为0.8～0.9，虽然TDEYA异常偏高，但苍术酮峰较小，相似度接近0.90。笔者推断此8批样品疑似有不同程度的关苍术掺伪，但掺伪比例需进一步确证。

基于含量测定结果，200批国家抽检样品中，有192批样品判断为苍术正品，8批样品判断伪品。8批伪品中有1批样品苍术素和苍术酮的比值为225，判断为关苍术，有7批比值在2～10，推断其可能有不同程度的关苍术掺伪，结果与指纹图谱结果一致。疑似掺伪样品检测结果见表3。

3 讨论

本课题组前期在UPLC-Q-TOF-MS/MS苍术化学轮廓图谱中已经发现，β-桉叶醇、TDDA和TDEYA是苍术正品和混伪品的主要差异特征峰之一，但由于苍术素和苍术酮等化合物在ESI源中离子化响应低[10]，无明显特征峰，为了更加全面、准确地反映苍术药材的品质差异，因此建立HPLC指纹图谱特征峰和含量测定的方法来快速筛查苍术混伪品。结果表明：①苍术正品和混伪品指纹图谱相似度差异较大，苍术正品指纹图谱相似度>0.90，混伪品指纹图谱相似度<0.90。②苍术酮/苍术素含量比值、TDDA和TDEYA的相对含量是区别苍术正品和混伪品的关键，苍术正品中苍术酮/苍术素含量比值<2，TDDA的相对含量高；苍术混伪品中苍术酮/苍术素含量比值>200，TDEYA的相对含量高。笔者分析苍术正品和伪品之所以会出现这种差异，是因为从遗传关系上来看，关苍术与白术的关系较近，北苍术与茅苍术的关系较近，而白术中苍术酮含量较高，茅苍术中苍术素含量较高[11-13]。

图5 1#样品指纹图谱相似度对比图

图6 部分北苍术样品指纹图谱相似度对比及放大图

表3 疑似掺伪样品检测结果

本实验通过HPLC技术建立一种基于指纹图谱相似度及苍术酮/苍术素的含量比值的苍术混伪品筛查方法，并完成200批苍术样品的检测。该方法稳定、可靠、重复性好，可用于苍术的掺伪检查，为完善苍术质量控制标准奠定了基础。对于样品中掺伪比例的问题，本研究尚未解决，后续将分析TDDA与TDEYA在不同品种苍术中含量规律，苍术素与苍术酮的含量比值在不同掺伪比例样品中的变化规律，期望通过特征成分定性加定量的方式，建立更加准确的掺伪检查方法。