唇形科四种种子的质量评价及萌发特性研究

杨蕊，周兰玉，文正莹，陈翠平，董帅，闫婕,▲，裴瑾,▲，彭成,

(1.成都中医药大学 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137；2.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；3.成都中医药大学 国家中药种质资源库， 四川 成都 611137)

唇形科Labiatae植物呈世界性分布，我国有99属800余种，其中仅2020年版《中国药典》收载以唇形科植物入药的中药材就有24种，具有较高的药用价值[1-2]。唇形科药用植物果实为小坚果，常有干而薄的外果皮，种子繁殖时常直接将小坚果用来播种，本文中统称为种子。该科种子常存在由萌发抑制物质引起的生理休眠(Physiological Dormancy,PD)，使得在实际栽培生产中萌发率低[3-4]。本试验通过对国家中药种质资源库收集的不同批次的丹参、广藿香、薄荷及黄芩种子进行质量评价及萌发特性研究，有利于中药材的规范化栽培，保障优质中药的生产，为中药种子入库标准的建立积累数据，为国家中药种质资源库保存和利用唇形科植物种子提供科学依据。

1 材料与试药

1.1 材料

试验所用实验材料由国家中药种质资源库采集组采集，在干燥间(温度15℃，湿度15%RH)干燥至含水量5%～7%后，存放于-20℃低温库保存。四种唇形科植物的不同批次种子采集情况见表1(编号为入库编号末尾三位数)。

表1 唇形科4种植物不同批次种子采集信息

1.2 仪器与试药

1.2.1 仪器

SteREO Discovery.V12体式显微镜及成像系统(德国Carl Zeiss)；MX-20射线辐射成像系统(美国Faxitron)；Selecta ZZ1.0 种子风选仪(德国Petkus)；TJD-1300种子净度工作台(浙江托普仪器有限公司)；GTOP-260B智能光照培养箱(浙江托普仪器有限公司)；mili-Q纯水仪(四川优普超纯科技有限公司)；JA1003电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.2.2 试药

琼脂粉(批号：2020120401)及赤霉素(批号：2019101401)购自成都市科隆化学品有限公司，萘乙酸(批号：C11926791)及6-苄基腺嘌呤(批号：C11457727)购自上海麦克林生化科技有限公司。

2 实验方法

2.1 取样

用分样板将样品在玻璃板上多次混合后摊成四方形，划两条对角线，取对顶三角形内的样品继续按上述方法分取，直至2个三角形内的样品接近2份试验样品的重量[5]。

2.2 种子及幼苗形态观察

每批种子选取20粒，游标卡尺测量其长和宽，再取5～10粒种子，于体视境下观察外观形态并采集图片；观察萌发后幼苗的形态、颜色等，于扫描仪下扫描拍照。

2.3 净度

调节风速，用风选仪除去相对实验样品重量较轻及较重的杂质，接着过筛或手工挑选，除去虫蛀、干瘪及杂种子及泥沙等杂质[6]。

种子净度(%)=净选后种子重量/供检种子质量×100%

2.4 健康度

每批取50粒种子，X-射线拍照。健康种子应饱满且结构完整；胚呈半透明状或有裂纹、孔道等。种子需剪切确认是否空瘪、变质或虫蛀，记录最终健康种子数目[7]。

健康度(%)=健康种子数/检测种子数×100%

2.5 千粒重

五十粒法测定。从样品中取出50粒，电子天平称重(精确度为0.001 g)，每批重复3次，计算每个重复的平均值、变异系数和标准差[8]。

变异系数(%)=标准差/平均值×100%

2.6 唇形科种子萌发特性的研究

2.6.1 培养基的配制

采用1%琼脂培养基，按照琼脂粉:水为1∶100往沸水中添加琼脂粉，煮至琼脂液澄清透明，晾至不烫手倒入一次性培养皿(1/2左右处)，凝固后塑封袋密封，倒置放入冰箱4℃冷藏备用。若配制含激素的培养基，需先配制1%琼脂水溶液，再称量适量激素加入琼脂液中搅拌至融化即可。

2.6.2 不同处理对种子萌发的影响

丹参种子每批选取90粒(播3盘，30粒/盘)，广藿香、薄荷种子每批次选取150粒(播3盘，50粒/盘)，黄芩种子选取105粒(播3盘，35粒/盘)，分别在25℃、25℃+划破果皮及15/25℃变温(12 h，12 h)下培养，光照2 000 lx。以胚根长出2 mm 为发芽标准，15 d后终止实验，每日记录数据，重复3次实验。丹参、黄芩计算第4天萌发势，广藿香及薄荷分别计算第3天萌发势及第5天萌发势。

萌发率= 试验结束发芽种子总数/供检种子总数 ×100%

萌发势= 规定日数内发芽种子总数/供检种子总数 ×100%

2.6.3 外源植物激素对种子萌发的影响

每种挑选一批次进行试验，考察不同浓度的外源赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)及6-苄基腺嘌呤(6-BA)对唇形科种子萌发的影响。按照以下浓度将外源植物激素配置入琼脂培养基中：

GA3(mg/L)：50、100、200、300、500；

NAA(mg/L)：10、25、50、100、200；

6-BA(mg/L)：10、25、50、100、200。

每种种子在同一浓度条件下平行播3盘(广藿香、薄荷50粒/盘；丹参、黄芩30粒/盘)，丹参、黄芩于15/25℃下培养，其余种子在25℃下培养，其中广藿香及黄芩需划破果皮，光照均为2 000 lx。按2.6.2项下方法观察、计算萌发率和萌发势。

2.7 统计学分析方法

将所得到的数据采用Microsoft Excel 2016进行处理，测定结果表示为(平均值±标准偏差)形式，用SPSS 25.0进行显著性分析，SigmaPlot 12.5进行绘图。

3 结果与分析

3.1 种子及幼苗形态观察[9]

3.1.1 丹参

丹参种子(实为果实)为棕褐或灰黑色，三棱状长椭圆形，长2.6～3.5 mm，宽1.3～3.0 mm。两头略尖或圆钝，背面拱凸或宽圆，腹面隆起成脊，圆形果脐位于纵脊基部，表面光滑无毛，斜面边缘圆滑。幼苗子叶2，墨绿色，卵圆形，长4.1～5.5 mm，宽3.5～4.0 mm，初生叶对生。胚轴圆柱形，远端白色，向上渐变为绿色。根长，常附细密根毛(见图1)。

注：左图种子；右图萌发1～8 d的幼苗

3.1.2 广藿香

广藿香种子(实为果实)为黄棕或棕褐色，三棱状长椭圆形，长1.4～1.9 mm，宽0.7～1.0 mm。顶端圆钝，背面略拱，腹面由两斜面组成，形成锐纵脊；果实一端被黄白色绒毛，一端有三角形果脐。幼苗子叶2，纸质，椭圆形，黄绿色，长2.2～3.0 mm，宽1.3～2.0 mm；初生叶对生，披针形。胚轴由浅绿色渐变为青绿色。主根长，侧根近水平伸展(见图2)。

注：左图种子；右图萌发1～7 d的幼苗

3.1.3 黄芩

黄芩种子(实为果实)呈三棱状椭圆形，长2.0～2.3 mm，宽1.0～1.8 mm。表面黑色，粗糙，密布疣状突起，背面隆起呈弓状，腹面相应弓状凹进，侧面具斜沟，相交于腹棱中上部的果脐处，灰白色果脐圆点状。幼苗子叶2，宽卵形或长椭圆形被灰白色绒毛，长2.4～5.5 mm，宽1.5～4 mm。初生叶对生，线状披针形。胚轴圆柱形，白色或红棕色；根长，常附根毛，偶见侧根(见图3)。

注：左图种子；右图萌发1～7 d的幼苗

3.1.4 薄荷

薄荷种子(实为果实)呈灰黑色或黑色，三棱状椭圆形，长1.6～2.0 mm，宽0.9～1.4 mm。表面光滑或粗糙，背面圆钝拱起，腹面形成纵脊，果脐生于纵脊基部，形似三角形，两端圆钝。幼苗子叶2，长卵形或心形，长2.0～3.5 mm，宽1.0～2.7 mm。初生叶对生，长卵形，边缘锯齿状。胚轴下部白色，上部渐变为浅绿色。主根长，可见侧根，斜向下伸展(见图4)。

注：左图种子；右图萌发1～8 d的幼苗

3.2 净度分析

丹参中杂质主要为碎叶、杂种子及空瘪种子，其中421批次的净度仅有30.62%。广藿香净度均在88%以上。黄芩种子除407批次净度仅有47.10%外，其余净度在75.39%～94.56%之间。薄荷种子净度均在88.64%以上(见图6)。

3.3 健康度

丹参种子健康度在68%～94%之间，421批次的健康度最高，363批次的最低。广藿香、黄芩、薄荷等种子的健康度均在94%～100%之间(见图5～6)。

图5 唇形科4种种子X-Ray检测图

图6 唇形科4种种子的净度和健康度

3.4 千粒重

唇形科4种种子千粒重的变异系数皆小于4%，测定值真实可靠[10]。丹参种子的千粒重在1.61～2.08 g之间；广藿香千粒重在0.42～0.46 g之间；黄芩在1.41～2.11 g之间；薄荷在0.62～0.83 g之间(见图7)。

图7 唇形科四种种子的千粒重及变异系数

3.5 唇形科种子萌发特性研究

3.5.1 不同处理对种子萌发的影响

丹参[11-14]、广藿香[15-17]、黄芩[18-20]、薄荷[21-22]等唇形科植物主要分布在我国的温带地区，其适宜萌发温度一般在15～25℃之间，因此设置25℃恒温和15/25℃变温来考察最适宜萌发温度。用于萌发的种子实为小坚果，果皮较厚硬，可能影响种子萌发，因此在25℃恒温条件下，比较划破果皮与不做特殊处理对种子萌发的影响。

丹参种子的萌发率为53.33%～66.39%，萌发势在47.27%～48.33%之间，组间虽无显著差异，但变温处理仍获得了最高的萌发率，这与李晓琳[11]等认为变温可促进丹参萌发一致。广藿香的萌发率在64.29%～74.76%之间，萌发势在46.38%～62.10%之间，划破果皮对提高萌发率有统计学意义(P<0.05)，15/25℃变温会显著降低萌发率和萌发势，有统计学意义(P<0.05)。黄芩的萌发率在80%以上，萌发势为57.89%～61.00%。划破果皮和变温条件均能显著提高种子萌发率，有统计学意义(P<0.05)。薄荷的萌发率在63.33%～68.83%之间，各处理组间萌发率无显著差异，15/25℃变温会显著降低萌发势，有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 唇形科种子的萌发率及萌发势

3.5.2 外源植物激素对唇形科种子萌发的影响

外源植物激素是常用的促进种子迅速均匀出苗的方法之一，其中赤霉素、生长素及细胞分裂素是常用的三种类型。文献报道，赤霉素(GA3)能有效解除腊梅[23]、牡丹[24]、山桃[25]等种子的休眠；生长素萘乙酸(NAA)可在一定浓度内促进薄荷种子萌发；而细胞分裂素6-苄基腺嘌呤(6-BA)可促进果蔬[26]、铁线莲[27]等种子萌发，解除休眠。根据前期实验结果，选择质量较优的338(丹参)、398(广藿香)、045(黄芩)、620(薄荷)批次种子，进行外源植物激素实验，结果见表3。

表3 不同外源植物激素处理后四种唇形科种子的萌发情况

在不同浓度的GA3中50 mg/L的GA3处理丹参种子的效果最佳。GA3处理后的广藿香及黄芩的萌发率及萌发势均高于空白对照，50～300 mg/L的GA3对促进广藿香萌发有统计学意义(P<0.05)。这与高赢[17]等认为GA3可在一定程度上提高广藿香种子的萌发率的观点一致。黄芩种子萌发率均显著高于对照组(P<0.05)，增幅为7.77%～13.33%，同时100 mg/L及500 mg/L的GA3对黄芩的萌发势的提高有统计学意义(P<0.05)。GA3对薄荷种子的萌发影响没有统计学意义，这与刘玉萍[21]等认为的100～300 mg/L GA3能显著提高青海野薄荷的萌发率及萌发势的观点不一致。

NAA对四种唇形科种子的萌发率呈先促进后抑制的趋势，萌发势随激素浓度升高而显著下降(P<0.05)。另外，NAA处理组的胚根较空白组的明显缩短，根略膨大，子叶和茎发育正常，长霉较严重。低浓度NAA(10 mg/L)处理组的萌发率较空白组有增加的趋势，但差异无统计学意义，其他处理组萌发率降低有统计学意义(P<0.05)。薄荷的萌发情况与牛文昊[22]等认为80～100 mg/L的NAA可促进薄荷萌发的观点不一致。

丹参、薄荷种子的萌发率随6-BA浓度升高而下降，25～200 mg/L的6-BA处理组表现抑制萌发作用(P<0.05)。广藿香种子的萌发率随激素浓度增加呈先升后降的趋势，其中50 mg/L及100 mg/L处理组组间差异有统计学意义(P<0.05)。6-BA处理能提高黄芩的萌发率(P<0.05)，增幅为7.77%～13.33%。但四种唇形科种子的萌发势均随6-BA浓度升高而降低(P<0.05)。

2. 表中的外源植物激素浓度编号1～5分别为，GA3(mg/L)：50、100、200、300、500；NAA或6-BA(mg/L)：10、25、50、100、200；CK为空白对照

综上所述，三种外源植物激素对唇形科种子的萌发影响显著。一定浓度GA3可提高丹参、广藿香、黄芩和薄荷四种唇形科种子的萌发率及萌发势，能够较好的打破唇形科种子的生理休眠，促进种子萌发。10 mg/L的NAA处理可提高四种唇形科种子的萌发率，一定浓度的6-BA处理可提高广藿香与黄芩种子的萌发率，但四种种子的萌发势均随激素浓度升高显著降低，发芽速度相对减慢。因此，GA3有利于唇形科植物种子的萌发；一定浓度的NAA及6-BA可提高部分唇形科种子的萌发率，但影响幼苗形态发育及胚根生长，不利于唇形科种子的萌发。

4 结论与讨论

常用药用植物种质资源的保存，有利于保存优质中药的基因多样性，为中药材良种选育提供物质基础。种子的质量将直接影响药材的质量和均一性，是中医药产业的持续健康发展的重要基石。丹参、黄芩、广藿香和薄荷为来源于唇形科植物的常用中药，黄芩主要用种子繁殖，也可扦插或分根繁殖；丹参常用分根繁殖，也可用种子或扦插繁殖；薄荷常用种子或扦插繁殖；广藿香常扦插繁殖。唇形科植物种子为正常型种子(Orthodox Seed)，可以在种子库的低温和干燥条件下实现长期保存。唇形科植物种子常均有生理休眠，

图8 三种激素处理四种唇形科种子的萌发情况

一定浓度的赤霉素处理可打破种子的生理休眠，提高种子萌发率或萌发势；种子实为小坚果，果皮较为坚硬，划破果皮处理也可提高某些种子的萌发率和萌发势。本实验将一定浓度的激素添加到琼脂培养基中，该处理方法能确保激素处理的浓度在实验过程中稳定、可控，实验数据更为可靠。四种唇形科种子以萌发率及萌发势为评价指标，最佳萌发条件分别为：丹参种子15/25℃，50 mg/L GA3培养基；广藿香种子25℃，划破果皮，50～300 mg/L GA3培养基；黄芩种子15/25℃，划破果皮，50～500 mg/L GA3培养基；薄荷种子25℃；光照均为2 000 lx，为种子库对唇形科种子的评价、研究与利用提供可借鉴的标准化操作。

国家中药种质资源库收集的种子在入库前及保存过程中都需进行质量检测，以保证库藏的种子具有较高的活力。查阅中药相关种子种苗标准可知，四种唇形科种子均未见国家标准，在四川、陕西、安徽、河北省地方标准有丹参[28-29]、黄芩[30-31]和薄荷[32]种子标准的收载。分析实验结果可知，在最佳萌发条件下，丹参及黄芩种子萌发率能达到85%以上，广藿香和薄荷的萌发率在75%以上，黄芩可以达到DB34/554-2005黄芩种子发芽率85%的标准；实验丹参种子用GA3处理打破休眠后萌发率远超过DB51/T1044-2010的发芽率25%和DB61/1102-2017d的发芽率55%的标准；丹参种子净度、个别黄芩种子千粒重及净度不能达到相关标准，提示种子入库前应有规范的净选环节。实验薄荷种子萌发率为78%，未达到DB/T 2704-2018发芽率80%的标准，可能与种子的采收期有关，还需进一步实验验证。参照地方中药种子标准以及实验数据，目前已建立相应物种的国家中药种质资源库入库标准。黄芩种子萌发率低于80%，丹参、薄荷和广藿香种子萌发率低于70%视为不合格种子，应重新采集。种子入库标准为国家中药种质资源库的有效运行提供科学依据。