预针刺小鼠足三里对穴区皮肤及穴旁淋巴结记忆T细胞的影响

黎明，刘楠楠，张健强，张薇，任鸿伟，蔡定均

(成都中医药大学 针灸推拿学院，四川 成都 610075)

针灸的“治未病”思想由来已久，早在《黄帝内经》时期就有对针灸治未病思想的论述，如《素问·刺热》云：“肝热病者,左颊先赤……病虽未发,见赤色者刺之,名曰治未病。”[1]“治未病”可分为未病先防和已病防变两方面，未病先防旨在加强人体“正气”来达到“邪不可干”的理想状态，已病防变则着重于控制疾病的发展与传变，即在原发病的基础上，控制继发病、并发症与后遗症的发生发展。预针刺是“治未病”思想的延续，指在身体无病时进行针刺预处理从而达到“治未病”的目的，是现代针灸常用的一种手段[2]。

“治未病”与现代免疫学思想存在诸多相通之处，两者均重视疾病的预防与控制。记忆T细胞(TM)是免疫记忆的产物，产生于细胞免疫介导的适应性免疫反应过程中，由少部分效应T细胞转化而成，在参与抗感染免疫[3]、机体衰老[4]和肿瘤免疫中扮演着十分重要的角色。记忆T细胞可根据表型及功能的差异分为中央记忆性T细胞(TCM)、效应记忆性T细胞(TEM)。通常认为，TCM表达CD45RO、L-选择素CD62(CD62L)以及趋化因子受体(CCR7)，主要存在于淋巴结内；TEM表达CD45RO，不表达或低表达CCR7和CD62L，可迁移至炎症局部发挥免疫作用。近年来，发现了TM的另一亚群即组织驻留性记忆T细胞(TRM)，不同于TCM和TEM，TRM不参与外周循环，并高表达CD69或/和CD103[5]。TRM可在组织局部快速介导免疫反应而无需特异性增殖[6-7]，在皮肤、胃肠道、肺脏等组织器官的抗感染免疫中发挥重要作用[8]。在无抗原持续刺激的条件下，TRM的定植与长期存活受局部组织微环境的影响[9]，Pan等[10]的研究也提示TRM可通过摄取游离脂肪酸并促进脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation，FAO)以维持其在局部的存在。针灸能调整机体固有免疫与适应性免疫功能，改变局部免疫微环境[11]，而这种改变是否足以影响TRM的定植还不清楚。腧穴是针灸疗效的基础，足三里是调整机体免疫的常用腧穴之一[11]，针刺过后穴位局部组织的免疫记忆是否与腧穴的治疗作用存在关联亦是未知。因此本课题选取健康小鼠，探讨 “预针刺”对小鼠足三里穴区皮肤及穴旁淋巴结记忆T细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级C57BL/6 雄性小鼠12只，9周龄，体质量(20±2)g，购于成都达硕实验动物有限公司【SCXK(川)2020-030】，喂养于成都中医药大学实验动物房内【SYXK(川)2019-049】，驯化一周。动物自由摄食、进水，控制室温22～24℃，湿度50%～60%，隔离房每0.5 h通风1次，自动控制光暗时间LD12:12(07:00～19:00开灯，19:00～07:00关灯)。小鼠根据体质量完全随机分组，分为空白组6只，预针刺组6只。本实验由成都中医药大学实验动物伦理委员会审核通过(审批号：2014-01)，实验全程遵守《关于善待实验动物的指导性意见》有关规定。

1.2 实验试剂

FITC标记的大鼠抗小鼠CD62L抗体(美国BD公司，批号：7004854)；APC标记的大鼠抗小鼠CD103抗体(美国BD公司，批号：7187747)；PerCP-CyTM5.5标记的仓鼠抗小鼠CD69抗体(美国BD公司，批号：8024741)；PE-CyTM7标记的大鼠抗小鼠CD3抗体(美国BD公司，批号：8072537)；PE标记的大鼠抗小鼠CD197(CCR7)抗体(美国BD公司，批号：7235504)；PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9062)；Collagenase I(英杰生命技术公司，货号：17100017)。

1.3 实验仪器

蜀康牌针具(0.30×13 mm，长春爱康医疗器械有限公司)；CytoFLEX流式细胞仪(美国Beckman公司)。

1.4 针刺方法

将预针刺组小鼠捆绑固定于自制固定装置上，穴位根据《实验针灸学》[12]中小鼠穴位图谱描述位置，选取右侧“足三里”穴(腓骨头下方约3 mm)手针针刺，1次/d，共10次，30 min/次，留针过程中每间隔5 min提插捻转行针1 min。针刺时间点基于早期研究成果，选择ZT12[13](19:00)时刻进行针刺。空白组小鼠仅在相同时刻捆绑固定，不做其余处理。

1.5 观察指标及检测方法

取材：小鼠经10次针刺治疗后，立刻颈椎脱臼处死，取右侧“足三里”穴区皮肤组织和腹股沟淋巴结，存放于4℃PBS溶液。

流式细胞术检测穴区TRM：剪碎穴区皮肤组织，加Collagenase I，37℃消化0.5 h，经300目尼龙网滤过后，250 g离心5 min，去上清，加入PBS控制细胞浓度到106/mL，流式管中加入细胞悬液100 μL，分别加入APC标记的大鼠抗小鼠CD103抗体3 μL、PerCP-CyTM5.5标记的仓鼠抗小鼠CD69抗体3 μL，于4℃避光孵育0.5 h，加入4℃的PBS磷酸盐缓冲液1 mL(PH值为7.4)，混匀后250 g离心5 min，去上清，并重复该步骤后(添加PBS，离心，去上清)，添加400 μL PBS缓冲液混匀，用流式细胞仪计数。

流式细胞术检测穴区或淋巴结CD3+TRM:剪碎穴区皮肤或淋巴结组织，加Collagenase I，37℃消化0.5 h，经300目尼龙网滤过后，250 g离心5 min，去上清，加入PBS控制细胞浓度到106/mL，流式管中加入细胞悬液100 μL，分别加入APC标记的大鼠抗小鼠CD103抗体3μL、PerCP-CyTM5.5标记的仓鼠抗小鼠CD69抗体3μL、PE-CyTM7标记的大鼠抗小鼠CD3抗体3μL，于4℃避光孵育0.5 h，加入4℃的PBS磷酸盐缓冲液(PH值为7.4)1 mL，混匀后250 g离心5 min，去上清，并重复该步骤后(添加PBS，离心，去上清)，添加400 μL PBS缓冲液混匀，用流式细胞仪计数。

流式细胞术检测腹股沟淋巴结CD3+TM亚群TCM和TEM：剪碎淋巴结组织，加Collagenase I，37℃消化0.5 h，经300目尼龙网滤过后，250 g离心5 min，去上清，加入PBS控制细胞浓度到106/mL，流式管中加入细胞悬液100 μL，分别加入PE-CyTM7标记的大鼠抗小鼠CD3抗体3 μL 、FITC标记的大鼠抗小鼠CD62L抗体3 μL、PE标记的大鼠抗小鼠CD197(CCR7)抗体3 μL，于4℃避光孵育0.5 h，加入4℃的PBS磷酸盐缓冲液(PH值为7.4)1 mL，混匀后250 g离心5 min，去上清，并重复该步骤后(添加PBS，离心，去上清)，添加400 μL PBS缓冲液混匀，用流式细胞仪计数。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 “预针刺”对穴区组织TRM的影响

如表1图1所示，与空白组相比，预针刺组CD69+CD103-TRM细胞、CD69-CD103+TRM以及总TRM细胞差异均无统计学意义；而预针刺组CD69+CD103+TRM细胞数量多于空白组(P<0.05)。

表1 穴区组织TRM数量

图1 穴区组织TRM数量

2.2 “预针刺”对穴区组织CD3+TRM的影响

如表2图2所示，与空白组相比，预针刺组各类CD3+TRM亚群细胞数量的差异无统计学意义；与空白组相比，预针刺组CD3+TRM数量多于空白组(P<0.05)。

表2 穴区组织CD3+TRM数量

图2 穴区组织CD3+TRM数量

2.3 “预针刺”对腹股沟淋巴结CD3+TM的影响

如表3图3所示，预针刺组腹股沟淋巴结TCM、TEM、CD3+TRM以及CD3+TRM各类亚群细胞数量与空白组比较差异均无统计学意义。

表3 腹股沟淋巴结CD3+TM数量

图3 腹股沟淋巴结CD3+TM数量

2.4 “预针刺”对穴区及腹股沟淋巴结各类TM比值的影响

如表4所示，与空白组相比，预针刺组腹股沟淋巴结TRM/TCM、TRM/TEM的差异无统计学意义。

表4 穴及腹股沟淋巴结各类TRM数量

3 讨论

“治未病”思想是中医智慧的体现，亦是作为“上工”的判断标准之一，即《内经》云：“善治者治皮毛。”[14]它强调在健康状态或发病之前采取预防措施阻止疾病的发生，同时也重视发病之后运用针药等手段避免疾病的加重。古代医者十分重视“治未病”思想，如孙思邈在《千金要方》中提到：“凡入吴蜀地游宦，体上常须三两处灸之……则瘴疠温疟毒气，不能著人也”[15]，张仲景《伤寒论》中也说到：“太阳病……若欲作再经者,针足阳明使经不传则愈。”[16]“预针刺”作为一种“治未病”的常用方法，亦能在未病先防和已病防变中发挥作用。在未病阶段，预针刺可对心血管系统、呼吸系统、内分泌系统等多个系统起保护作用[17]；在已病阶段，如对于卵巢早衰患者，针刺可以缓解围绝经期症状，下调血清性激素水平，一定程度上延缓了卵巢衰竭的发生[18]。“足三里”是长寿保健的要穴，《千金方》云：“若要安，三里常不干”，现代研究也发现针刺“足三里”可对机体免疫功能产生积极作用[19-20]。

扶正是“治未病”思想中的重要一环，“正气”的强弱和机体免疫能力密切相关。免疫是机体排除“异己”的过程，无论是外来病原体还是机体肿瘤细胞，均可成为“异己”。免疫可分为两类，一类是与生俱来的能力即先天性免疫，另一类是后天习得的能力即适应性免疫，TM便是在此适应性免疫中产生。当“异己”被识别时，B细胞和T细胞将会从细胞免疫和体液免疫中发挥各自不同的作用，B细胞分化成浆细胞与记忆B细胞(BM)，少数的T细胞分化为TM，由此产生免疫记忆，当相同“异己”再次入侵时，免疫记忆被唤醒，启动机体迅速强大的免疫反应。皮肤作为面积最大的器官，为机体抵御外界不良刺激和微生物入侵起到关键作用，同时，又是机体固有免疫和适应性免疫的重要组成部分。早在上世纪80年代，国外研究者便提出了皮肤免疫以及皮肤相关淋巴组织SALT(Skin-Associated Lymphoid Tissue)的观点[21]，之后的研究更进一步将皮肤定义为外周免疫器官[22]。研究发现，皮肤中的T细胞数量多达200亿，是血液系统中的两倍[23]，而皮肤组织中的TM主要为TRM[24]。TRM可长期驻留于皮肤及黏膜等处，不进入体循环，TRM可快速介导免疫反应而无需依赖于体循环T细胞的补充[25-26]。TRM可直接裂解靶细胞，又可募集循环中CD8+TM，进而释放细胞因子激活自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(DCs)、T细胞和B细胞，是局部组织中发挥抗感染作用的重要免疫细胞[7,27]。TRM虽不参与外周循环，但可借助伪足在定植组织周围来回迁移，完成“巡逻”的任务[28]。TRM可由进入组织中的TEM或TM转化而成，该过程受bcl-6、eomes[29]等转录因子以及S1P1[30]、CCR7[7]等细胞膜受体的影响，此外，局部组织微环境中IL-15、TGF-β[31]也可调控TRM的形成。

从本次实验结果可知，健康小鼠皮肤中存在一定数量的TRM，其中主要以CD69+TRM为主，CD103+TRM较少；健康小鼠淋巴结CD3+TM中绝大多数为TEM，存在少量的TRM和TCM；预针刺可明显增加穴区组织CD69+103+TRM以及CD3+TRM数量，对穴区组织CD3+TRM亚群和淋巴结CD3+TM亚群数量变化无显著影响；预针刺对穴区TRM/淋巴结TRM比值、淋巴结内TRM/TCM比值、淋巴结内TRM/TEM比值均无显著影响。

近年来科研工作者对TRM的关注度越来越高。研究证实TRM与某些皮肤病如银屑病[32]、白癜风[33]以及自身免疫疾病如溃疡性结肠炎、支气管哮喘[34]的发生密切相关。在肿瘤研究方面，TRM也是关注的重点。研究发现，对于大体积的肿瘤，CD8+TRM可使其体积缩小，从而缓解疾病[35]。CD8+TRM浸润程度与肿瘤患者预后正相关[36]。不仅如此，CD8+TRM可通过增加抗原传递细胞处理肿瘤抗原的能力来加强抗肿瘤免疫反应[37]。

基于以上认识，我们有理由相信预针刺对某些感染性疾病、自身免疫疾病和肿瘤的预防和治疗作用可能是通过TRM实现的，本实验不足之处在于没有验证疾病状态下，针刺是否能通过TRM阻止或延缓疾病的进展，另外，本实验仅研究了足三里穴区组织TRM的变化，而不同穴区或非穴区组织TRM的数量是否存在差异仍是未知，这也将是课题组今后研究的一个方向。

综上所述，预针刺足三里可显著增加穴区组织记忆T细胞中的CD69+103+TRM以及CD3+TRM数量，这可能是针灸治未病应用在感染性疾病、自身免疫疾病和肿瘤疾患中的科学基础之一。