蛇胆川贝液中蛇胆汁的掺伪筛查与现行标准商榷

刘德丽，马斐，张艳红，张静，任菲菲

(德州市食品药品检验检测中心，山东 德州 253015)

蛇胆川贝液为祛痰止咳类非处方药，其主要成份为蛇胆汁和平贝母，辅料为杏仁水、薄荷脑和防腐剂等，用于风热咳嗽，痰多气喘，胸闷，咳嗽不爽或久咳不止。经国家药品监督管理局数据查询系统查询，蛇胆川贝液共有138个生产厂家，遍布湖北、广西、吉林、江西、山东等十多个省份。近年来不同厂家蛇胆川贝液多次出现在药品质量公告不合格名单中，同时经市场调查发现不同厂家产品售价在几元到几十元不等，价格差异悬殊，提示其原料质量或生产工艺存在较大差别。

蛇胆汁具有止咳化痰、疏风定痛的功效，是蛇胆川贝液中的主药，其原料的优劣和投料量直接影响成药的疗效。蛇胆汁虽然临床应用广泛、历史悠久，但目前尚无统一的国家标准，《中国药典》2020年版一部未收载蛇胆汁的质量标准，仅在四部[1]“成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片”中指出“蛇胆汁为眼镜蛇科、游蛇科或蝰科动物多种蛇的胆汁”；湖南、甘肃、江西、安徽、福建等省地方药材标准有收载，但其名称、来源、质量控制指标和项目不同[2-6]。由于资源稀缺、价格昂贵、质量标准不统一，导致市售蛇胆汁药材来源复杂，亦存在以猪、牛、羊等其他动物胆汁掺伪入药的现象，而不同动物胆汁的化学成分和药理作用存在较大差异[7]，不宜替代混用。针对这一现状，国内外学者[8-15]进行了大量研究，其中马婷婷等[13]对安徽安科余良卿药业有限公司提供的12批蛇胆汁及猪、牛、羊兔四种动物胆汁进行研究，薄层色谱显示12批蛇胆汁均检出与牛磺胆酸钠对照品相应的斑点，各批蛇胆汁在一定Rf值范围内差异明显，与蛇胆汁对照药材在斑点颜色和亮度上均有差异；12批蛇胆汁均含有牛磺乙酸，猪、牛、羊、兔胆汁中未检出此种物质；猪胆汁中检出甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)，蛇胆汁中未检出。陈家春团队[14-15]对44批自采蛇胆汁、3批商品蛇胆汁及24批常见掺伪动物胆汁进行成分分析与比较，发现猪胆汁中含有大量GHDCA，而蛇胆汁中未检出；牛、羊胆汁成分相似，含有较多的牛磺胆酸和甘氨去氧胆酸，二者含量之比在1∶1.14～29.26之间；蛇胆汁中牛磺胆酸含量高、甘氨去氧胆酸含量低，二者含量之比大于6 156∶1。可利用以上差异对蛇胆汁和其他动物胆汁进行鉴别。

蛇胆川贝液现执行质量标准为国家食品药品监督管理总局国家药品标准WS3-B-1832-94-2016[16]，检验项目包括性状，平贝母、蛇胆汁的薄层鉴别，装量、相对密度、pH值等常规检查项，氢氰酸、牛磺胆酸的含量测定，项目比较完善，但是缺少蛇胆汁专属性指标的检测。因此，本研究采用液相色谱串联质谱法对蛇胆川贝液中的蛇胆汁是否存在其他动物胆汁掺伪进行筛查，同时对现行标准提出合理化建议，以期为更加科学有效的控制药品质量提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

液质联用色谱仪(TSQ Quantum Access MAX，赛默飞世尔科技有限公司)，电子分析天平(XS105DU，德国梅特勒-托利多公司)，自动液液萃取仪(STC-302A，济南盛泰科技有限公司)。

1.2 试药

甘氨去氧胆酸(GDCA)对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20070808，含量：98.0%)；甘氨猪去氧胆酸对照品 (四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20050711，含量：98.0%)；牛磺胆酸钠对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110815-201911，含量：87.3%)；蛇胆汁对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120938-201707)。乙腈、甲醇为色谱纯，购自默克化工技术有限公司；冰乙酸、乙酸铵为色谱纯，购自阿拉丁试剂有限公司；水为娃哈哈瓶装饮用纯净水；其他试剂均为分析纯。蛇胆川贝液样品共35批，来自13个生产厂家，见表3。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 供试品溶液[16]精密量取本品20 mL，用乙醚振摇提取2次(20 mL、15 mL)，水液备用，合并乙醚液，用水洗涤2次，每次5 mL，分别分取水液，与备用水液合并，置水浴上蒸至无醚味，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5 cm，柱高为10 cm)，用水200 mL洗脱，弃去水液，再用乙醇60 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液 实验室前期检验结果表明，35批蛇胆川贝液样品中牛磺胆酸含量均低于300 μg/mL，其中1批样品含量为11 μg/mL，不符合标准规定(不得少于105 μg/mL)，其余34批样品含量均符合标准规定。根据文献资料[14-15]计算得样品中GDCA含量应低于50 ng/mL,按1.2.1制备的供试品溶液中GDCA的浓度应低于200 ng/mL，因此按如下浓度进行对照品溶液的配制。分别称取GHDCA对照品10.17 mg、 GDCA对照品10.08 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得混合对照品储备液。临用前精密量取混合对照品储备液1.0 mL置200 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得工作溶液。精密量取上述工作溶液2.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL分别置5 mL、10 mL、20 mL、50 mL、100 mL量瓶中，用甲醇稀释制成GHDCA浓度为199.3、99.67、49.83、19.93、9.967 ng/mL，GDCA浓度为197.6、98.78、49.39、19.76、9.878 ng/mL的系列标准溶液。

2.2 液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)；流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液(用冰乙酸调至PH 4.0)、流动相B为乙腈∶甲醇(1∶3)[11-13]，按表1梯度进行洗脱。0～10 min的色谱柱洗脱液由六通阀切换至废液，10～15 min进质谱检测。

表1 流动相梯度

2.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：多反应监测(MRM)模式；毛细管电压：-3 000 V；蒸发温度：300℃；鞘气：30 units；辅气：10 units；毛细管温度：350℃。质谱参数见表2。

表2 质谱参数

2.4 测定法

分别取供试品溶液和混合对照品溶液各10 μL，注入液质联用仪，测定。

2.5 结果判断

以m/z 448.1→73.9、m/z 448.1→386.2和m/z 448.1→368.2提取的供试品离子流图色谱中，若同时出现与GHDCA对照品保留时间一致(偏差在±5%以内)的色谱峰，且离子丰度比与浓度相当的对照溶液的离子丰度比一致，则说明存在猪胆汁掺伪。以m/z 448.1→73.9和m/z 448.1→386.2提取的供试品离子流色谱中，若同时出现与GDCA对照品色谱保留时间一致(偏差在±5%以内)的色谱峰，且供试品中m/z 448.1→73.9的峰面积超过GDCA对照品中m/z 448.1→73.9的峰面积，则说明存在牛、羊胆汁掺伪。

2.6 方法学考察

2.6.1 检出限与定量限 精密移取浓度约为10 ng/mL的对照品，以甲醇为溶剂逐级稀释，采用上述方法进样测定，按S/N≥3计算检出限，S/N≥10计算定量限，则GDCA色谱峰(m/z 448.1→73.9)的检出限为0.6 ng/mL，定量限为1.9 ng/mL；GHDCA色谱峰(m/z 448.1→386.2)的检出限为0.3 ng/mL，定量限为0.8 ng/mL。

2.6.2 样品残留 在测定高浓度对照品(约200 ng/mL)之后，运行一针空白溶剂(甲醇)，结果图谱中未出现与对照品保留时间一致的色谱峰，表明该方法无明显残留，在分析高浓度样品后无需清洗系统即可进行后续样品的分析。

2.6.3 线性范围考察 取“2.1.2”项下的系列标准溶液注入液质色谱仪，同一浓度溶液连续进样3次，记录GHDCA中m/z 448.1→386.2离子的峰面积和GDCA中m/z 448.1→73.9的峰面积。分别以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。得GHDCA回归方程：Y=686.79X-208 0.3(R2=0.998 8)，线性范围为199.3～9.967 ng/mL；GDCA回归方程：Y=75.524X-473.82(R2=0.999 3)，线性范围为197.6～9.878 ng/mL。

2.6.4 精密度 取含GHDCA 99.67 ng/mL、GDCA 98.78 ng/mL的混合对照品溶液，按上述方法测定，记录GHDCA中m/z 448.1→386.2离子的峰面积和GDCA中m/z 448.1→73.9的峰面积，计算其RSD值，分别为1.82%、1.10%，说明该法精密度良好。

2.7 试验结果

经检测，13批样品检出GHDCA，说明存在猪胆汁掺伪；1批样品检出GDCA，且m/z 448.1→73.9的峰面积大于对照品中m/z 448.1→73.9的峰面积，说明存在牛胆汁、羊胆汁掺伪。色谱图见图1至图4，结果见表3。

图1 混合对照溶液的液相质谱图图2 猪胆汁掺伪样品的液相质谱图图3 牛、羊胆汁掺伪样品的液相质谱图图4 阴性样品的液相质谱图

表3 非法添加猪胆汁、牛胆汁及羊胆汁的筛查结果

3 讨论

实验室前期按法定标准对35批样品进行检测，结果1批不合格，不合格率为2.9%；而用LC-MS法对样品进行蛇胆汁掺伪筛查，结果14批存在其他动物胆汁的非法添加，占比40.0%。说明现有标准不能真实全面地反映药品质量，亟待提高和完善。

实验室进行多次试验研究和对比，发现法定标准[16]鉴别(1)中的方法存在不足，一是蛇胆汁对照药材溶液浓度偏低，经点样、展开、显色后，Rf值小于牛磺胆酸钠的斑点不能清晰显示，见图5；其他实验条件不变，增加对照药材溶液的点样量，得到的色谱图中Rf值小于牛磺胆酸钠的斑点隐约可见但不够清晰，且出现拖尾、扩散现象，见图6；其他实验条件不变，增大对照药材溶液的浓度(将标准中“……残渣加无水乙醇4 mL使溶解”改为“……残渣加无水乙醇1 mL使溶解”)，得到了斑点清晰的色谱图，见图7。二是供试品溶液显示的斑点较多，且部分斑点分布集中，不易观察，后期与LC-MS结果进行比较，发现掺伪样品(图5中样品1、6，图7中样品1、4、5)和未掺伪样品(图5中样品2、3、4、5、7，图7中样品2、3)的薄层斑点无明显差异。此外薄层色谱法的试验结果容易受环境温湿度、操作人员熟练程度等因素的影响，重现性较差，对于性质相似的组分不易区分和鉴别。

S.牛磺胆酸钠对照品 YC.蛇胆汁对照药材溶液

1.点样量5 μL 2、3.点样量10 μL 4.点样量15 μL

S:牛磺胆酸钠对照品 YC:蛇胆汁对照药材溶液

由表3数据可知13家企业中有5家企业的样品生产过程中使用了掺伪的蛇胆汁，包括A企业5批，C企业4批，B企业2批，D企业2批，M企业1批。对于样品量3批及以上的企业进行掺伪率统计，则A、B、C、D、E企业样品的掺伪率分别为：45.5%、50.0%、100.0%、50.0%、0.0%。说明蛇胆汁掺伪不是偶然现象，是由于部分企业对原料质量的把控能力差或者把控不严格造成的。蛇胆汁原料质量的优劣也决定了其产品售价的差异。

4 小结

蛇胆汁自古以来就是一味名贵稀缺的中药，以其为原料的蛇胆川贝液、蛇胆川贝散、牛黄蛇胆川贝液等中成药临床应用广泛，但现行质量标准中均无针对蛇胆汁专属性成分的检测项目。随着检验仪器的不断发展和检验技术的日益完善，专家学者对蛇胆汁及其制剂的研究逐步深入。本研究采用液相色谱串联质谱技术对蛇胆川贝液中的蛇胆汁进行掺伪筛查，结果显示市售蛇胆川贝液质量参差不齐，不同厂家产品存在明显的质量差异，多个厂家存在其他动物胆汁伪充蛇胆汁入药的情况，尤其是用猪胆汁掺伪的情况严重，应予以关注。蛇胆川贝液现行标准[16]鉴别(1)中的薄层色谱法可判断蛇胆汁是否投料，但不能有效筛查是否存在掺伪情况，此外根据本研究结果建议增大蛇胆汁对照药材溶液的浓度以得到清晰的薄层色谱图；含量测定项检测指标牛磺胆酸不是蛇胆汁的特有成分，其含量亦不能反映产品的真实质量，因此针对蛇胆汁进行质量控制的检验项目应予以修订提高，建议增加杂胆汁的掺伪筛查方法，建立多元化质控标准。监管及相关技术部门应对企业加强监督和跟踪调查，同时为企业提供必要的技术支持，督促其从源头把控药品质量。