太平洋海马的性状鉴别和COI-ATP6条形码分子鉴定研究

来梦茹，孙思雅，方昀，陈建真，葛宇清，张光霁，程汝滨▲

(1.浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053;2.浙江中医药大学 第一临床医学院，浙江 杭州 310053)

海马是海洋动物类药材，具补肾壮阳益精、活血散结、消肿止痛等功效[1]。《中国药典》2015年版收载了五种药用海马，分别为小海马Hippocampusjaponicus、大海马H.kuda、刺海马H.histrix、线纹海马H.kelloggi、三斑海马H.trimaculatus的干燥体[2]。药用海马在中医药领域中占有重要地位，但过度捕捞开采使海域中的野生海马资源逐渐贫乏，我国海马药材供不应求，进口和走私现象日益增多。目前中药材市场上的海马品种繁多，名称混淆不清、混用替代的现象屡见不鲜，非药典品种的伪品的流通使用，严重降低了海马药材的医疗保健价值，破坏了中药材市场秩序，而且对海马本身的开发利用也有一定危害[3-4]。

太平洋海马(Hippocampusingens)是一种东太平洋特有的海马，野生资源丰富，幼崽存活率高，适应性好[5]。太平洋海马体型巨大，符合临床以海马体型大为质量佳的用药习惯，故常被作为药典品种大海马的伪品流通使用，是目前中药材市场主要流通的非药典海马品种之一，市场销售量占比高达11.95%[6]。目前关于太平洋海马的基础研究工作仍处于起步阶段，因缺乏最基本的药材性状特征和DNA条形码序列等基本的生药学信息，限制了对太平洋海马的进一步研究，迫切需要加强太平洋海马的鉴定和开发等相关研究工作。因此，本文拟建立太平洋海马的DNA条形码鉴定技术，明确其典型性状特征及COI和ATP6条形码的分子鉴定能力，为太平洋海马的快速准确鉴定提供技术保证。

1 材料

1.1 药材

本实验共收集25份来自不同地区药材市场及海马养殖厂的海马药材样品。所有海马干燥体样品经浙江中医药大学第一临床医学院葛宇清副研究员鉴定，确认为太平洋海马(H.ingens)、三斑海马(H.trimaculatus)、直立海马(H.erectus)、棘海马(H.erectus)和小海马(H.japonicus)的药用干燥体。将所有样品标记名称后，于洁净密封袋中避光保存，样品保存于浙江中医药大学药学院。同时在GenBank数据库中下载9条未收集到的海马和海龙的COI和ATP6序列(含线纹海马3条，大海马2条，刺海马2条，拟海龙和刁海龙各1条)，样本来源及其DNA条形码序列信息详见表1与表2。

表1 材料来源及条形码序列信息

表2 样品DNA条形码序列信息

1.2 实验试剂

海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，批号：N1228)；琼脂糖粉(法国biowest公司，批号：111860)；50×TAE缓冲液(上海生工生物工程股份有限公司，批号：F326KA1304)；DL2000 DNA Marker(批号：A701D)、10×PCR buffer(批号：AI60888A)、dNTP Mix(批号：BL2501E)、r-Taq酶(批号：AI70714A)均购于北京宝日医生物技术有限公司。

1.3 主要仪器设备

GL323-1SCN多功能精密电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一有限公司)；G8023CSL-2C型微波炉(广东格兰仕微波生活电器制造有限公司)；S1000TM Thermal Cycler 基因扩增仪(美国Bio-rad公司)；Universal Hood III型凝胶成像系统(美国Bio-rad公司)；ND-2000C超微量分光光度计(赛默飞世尔科技公司)。

2 方法

2.1 DNA提取

根据海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取10个太平洋海马样品的总DNA，用超微量分光光度计检测所提取DNA模板的纯度和浓度。将提取合格的DNA模板置于-20℃冰箱内保存。

2.2 PCR扩增及测序

利用普通PCR进行扩增，COI和ATP6基因扩增条件相同。50 μL扩增体系中包含5 μL 10×PCR buffer、5 μL dNTP Mix、0.5 μL r-Taq酶、2.5 μL模板DNA、各1 μL上、下游引物、以及35 μL ddH2O。PCR反应首先经94℃预变性5 min后，再经过33次94℃变性45 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min的循环，最后72℃延伸15 min，得到扩增产物。将适量琼脂糖高温溶解于TAE缓液中，冷却片刻后加入荧光染料，制成1%琼脂糖凝胶。DNA扩增产物和DNA maker在凝胶中进行负极至正极的电泳，在凝胶成像系统上成像，记录PCR产物的大小和质量，后送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。扩增和测序所用的PCR引物序列见表3。

表3 PCR引物序列

2.3 数据处理与序列分析

将扩序成功的DNA序列在DNA数据库中进行相似性比较，即利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析工具，确定序列正反方向。剔除上下游引物序列后，再用Clustal W分析工具进行多序列比较，两两产生同源性。将序列分析结果提交至GenBank数据库，登录号详见表2。利用MEGA 7.0软件计算每条DNA序列的碱基组成，基于K2P双参数模型分析碱基变异位点、信息位点、转换/颠换、种内及种间遗传距离等；通过邻接法构建系统进化树，分析太平洋海马与其它海马之间的亲缘关系。

3 结果

3.1 性状特征鉴别

本文在相关文献报道和实地样本观察的基础上[5]，总结了太平洋海马干燥体的性状特征，其典型的鉴别特征包括体型巨大，体表光滑，全身密布白色竖线纹，颊棘长而明显，雄性海马通常有一个突出龙骨。除此以外，太平洋海马一般平均体长13～19 cm，头冠向后倾斜，眼棘突出，躯干部有6～10个黑色斑块，通常具38～40个尾环。干燥太平洋海马性样本状特征如图1所示。

图1 干燥太平洋海马样品典型特征

3.2 太平洋海马不同条形码序列分析

本研究通过对太平洋海马样品的COI和ATP6基因片段进行PCR扩增及测序，通过Mega 7.0软件对太平洋海马内两种基因序列的碱基组成、变异位点、信息位点等进行分析，序列分析结果见表4。在10个太平洋海马样品中，COI序列全长均为649 bp，GC平均含量为40.71%；ATP6序列长度为603 bp，GC平均含量占36.58%。此外还发现，同一条形码序列中存在不同的单倍型和变异率，其中COI序列存在5种单倍型，ATP6序列存在7种单倍型。COI序列和ATP6序列的变异位点分别为7和12 bp，其序列在种内的变异率分别为1.079%和1.990%。

表4 太平洋海马扩增序列分析信息

3.3 太平洋海马与常见海马不同序列遗传距离分析

将太平洋海马样品的COI和ATP6序列与其他7种常见海马样品的序列进行分析，基于K2P参数模型计算太平洋海马的种内和种间遗传距离(图2)。太平洋海马种内遗传距离分析结果显示，COI序列最大种内遗传距离为0.009 3，平均种内遗传距离为0.002 8，ATP6序列最大和平均种内遗传距离均大于COI序列，分别为0.010 1和0.006 9，提示ATP6基因在太平洋海马中的进化速率较COI更快。太平洋海马与其它常见海马的种间遗传距离分析结果表明，在COI序列中，太平洋海马与刺海马的种间遗传距离最大，为0.134 9；在ATP6序列中，太平洋海马与小海马的遗传距离最大，为0.183 3。此外，两个序列均与大海马的种间遗传距离最小，分别为0.027 7和0.059 7，说明太平洋海马可能与大海马的亲缘关系较近。

A.基于COI序列的种内种间遗传距离 B.基于ATP6序列的种内种间遗传距离

3.4 太平洋海马与常见海马NJ树聚类分析

为进一步验证太平洋海马与其它常见海马间的亲缘关系，本实验通过邻接法构建NJ树进行聚类分析，对COI和ATP6序列的鉴定效率进行了分析。图3-A和3-B结果表明，由COI序列和ATP6扩增所得的太平洋海马样品均单独聚成一个大分支，其分支支持率为99%和100%，表明能与其它海马明显区分，后均与大海马聚为一支，支持率均为100%，结果与种间距离分析一致，说明太平洋海马与大海马的亲缘关系最近。在COI序列和ATP6序列所构建的NJ进化树中，10个太平洋海马样品均能聚集成独立大分支，但两个大分支中仍存在不同的太平洋海马小分支，COI序列中存在3个分支，ATP6序列中存在7个分支，且支持率均在50%以上。因此，我们猜测10个太平洋海马样品可能来自不同的群体，不同群体间太平洋海马间的差别和遗传分化可能已达到亚种的水平。分析结果也提示了ATP6基因可以作为鉴定海马药材不同群体遗传的DNA条形码，用于后续的开发研究。

注：A.基于COI序列的NJ树；B.基于ATP6序列的NJ树

4 讨论

本文对太平洋海马的典型性状特征和经典DNA条形码进行了系统研究，明确了太平洋海马形态鉴别特征包括体型巨大、全身密布白色竖线纹和颊棘长而明显等特征，同时对太平洋海马的COI和ATP6序列的种内种间变异率、遗传距离和NJ树聚类进行了分析，结果表明这两种序列均可用于准确区分太平洋海马与其他常见市售海马，且太平洋海马与大海马亲缘关系最近。

中药鉴定是对中药的品种、质量进行研究，并制定相关标准，是中药研究及扩大药源的基础和保证。中药性状特征的差异应追溯到其基因型的差异，即在DNA序列上的差异[7]。DNA条形码技术(DNA barcoding)是近年来国际上兴起的有关物种鉴定的新技术，能够利用若干个标准DNA片段对物种进行快速、准确的鉴定[8]。动物类药材常选择核糖体或线粒体中的部分基因作为分子标记物，如核糖体中的ITS1和ITS2基因，以及线粒体中的Cyt b、COI、12S rRNA基因[9]，且采用组合条形码更有利于提高物种鉴定率。本课题组此前已经对包括小海马、棘海马等在内的多种市售海马进行生药学研究[10-11]，验证了COI条形码可作为海马药材分子鉴定的基础条形码，ATP6和16S rRNA可作为其补充条形码，在海马亲缘关系研究及药材正伪鉴定中发挥重要作用。本文选择了COI和ATP6序列作为太平洋海马鉴定的DNA条形码，研究了太平洋海马中COI和ATP6条形码的遗传变异和鉴定效率。通过遗传距离分析发现，太平洋海马与大海马的COI和ATP6基因的最小种间遗传距离分别是其最大种内遗传距离的2.98倍和5.91倍，均未达到确定物种界限所需的DNA条形码间隙(barcoding gap)，提示太平洋海马与大海马的亲缘关系极近。从文中所构建的NJ树可以看出，COI和ATP6基因虽然都能够将太平洋海马从其他不同品种的海马样品中区分，但ATP6序列中的太平洋海马所形成的分支更稳定，提示太平洋海马样品可能来自不同群体。此外，与DNA条形码相比，线粒体全序列包含更丰富的遗传信息，在物种的遗传标记、生物地理学和系统进化研究中被广泛使用。Zhang[12]等完成了太平洋海马的线粒体全序列测定工作，完善了太平洋海马线粒体基因结构及系统进化树等信息，为太平洋海马的进一步鉴定与开发保护提供数据支持。与大海马线粒体基因组全序列比较，两者基因组结构相似，其序列同源性高达96.75%，进一步证实了太平洋海马和大海马极为相近的亲缘关系。

由于海马药材在中医药领域处于重要地位，供需矛盾所造成的过度开发使野生海马资源逐渐贫乏，这一现象与早年正品甘草资源衰竭的情况相似。由于正品乌拉尔甘草资源不足，1977年版起《中国药典》新增光果甘草和胀果甘草两种品种，减轻市场用药需求[13]。一药多基原对扩大药源、满足制药需要、保障临床用药的需要都有一定的促进作用。历版《中国药典》对海马基原动物的记载也有所变动，《中国药典》1963年版首次确定药用海马的基原动物为克氏海马、大海马、三斑海马和刺海马，直至1977年版才新增小海马，至此药用海马的品种再未增加。本文分子鉴定结果提示，太平洋海马与药典正品海马大海马亲缘关系最近。太平洋海马野生资源分布广泛，其适应性较强，在正品海马资源逐渐匮乏的大背景下，后期应加强对太平洋海马毒理学、药效学评价和化学组成的基础研究工作，并与其他正品海马进行比较。在保证太平洋海马的用药安全和临床疗效的前提下，时机和条件成熟时可考虑将太平洋海马纳入《中国药典》海马基原项下进行管理，在扩大海马药源，保护海马资源的同时，也能改善海马药材市场名字模糊不清、鱼目混珠的现状，有效维护海马药材的市场秩序。