“俄色叶”饮片质量标准研究

陈蓉，陈华林，徐俊，蔡晓洋，敬勇，李敏

(1.成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 611137；2.中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137)

因俄色叶因具有良好的“降三高”作用，部分公司已进行俄色叶的试生产和试销。另外，有研究表明，俄色叶可制成俄色黄酮分子胶囊[7]、俄色-A毛囊靶向脂质体[8]、俄色总黄酮缓释栓剂与片剂[9]、俄色黄酮微囊[10]、俄色黄酮-β-环糊精包合物[11]、复方颗粒剂[12]等药物，具有极高的临床应用价值。

目前俄色叶饮片尚无标准可依，无法有效保障其质量的稳定性和可控性，因此建立俄色叶饮片标准显得尤为迫切。本文通过对俄色叶饮片进行质量研究，为全面控制俄色叶饮片质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、SQP电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、HWS型恒温恒湿培养箱(北京中兴伟业仪器有限公司)、ULUP-IV-10T优普系列超纯水仪(四川优普超纯科技有限公司)、ZF-90多功能暗箱式紫外透射仪(上海宝山顾村电光仪器厂)、DZKW-4型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)、A580型紫外可见分光光度计(翱艺仪器上海有限公司)、安捷伦1200高效液相色谱仪(DAD检测器，安捷伦科技有限公司)。

1.2 试药

根皮素对照品(纯度≥98%，批号：wkq18032810)，根皮苷对照品(纯度≥98%，批号：wkq18050407)，均由四川省维克奇生物科技有限公司提供。甲醇(赛默飞世尔科技公司，色谱纯，批号：LOT145176)。甲醇(批号：2017090101)、甲酸(批号：20110510)、乙醇(批号：2017022801)、乙酸乙酯(批号：2017051201)等为分析纯，均购于成都市科隆化学品有限公司。

30批俄色叶饮片由四川兴盛源药业有限公司提供，经由成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶。其中15批采用净制的方法炮制，另外15批采用切制的方法炮制。俄色叶饮片详细信息见表1。

表1 俄色叶饮片样品来源

2 方法及结果

2.1 性状

对收集到的30批饮片的形状、大小、色泽、表面特征、气、味等进行研究。结果表明，不同饮片的性状略有不同。见表2，图1～4。

表2 净制饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物测定结果n=3，%

图1 净制俄色叶(变叶海棠)

图2 净制俄色叶(花叶海棠)

图3 切制俄色叶(变叶海棠) 图4切制俄色叶(花叶海棠)

净制饮片叶易皱缩，完整者呈卵形或椭圆形，先端渐尖或急尖，边缘钝锯齿或微锯齿，常具不规则3～5个深裂，亦有不裂。上表面多为暗绿色或浅棕绿色，疏被柔毛；下表面多为灰绿色或灰棕色，被柔毛，叶脉尤甚；叶柄被柔毛。质脆。气微香，味微苦。见图1～2。

切制饮片为不规则碎片，叶片暗绿色。见图3～4。

2.2 鉴别

2.2.1 显微鉴别

通过对两种饮片的叶中脉横切面及粉末进行观察和测量，其显微鉴别特征总结如下。叶中脉横切面：上下表皮各1列细胞，排列紧密，切向延长，可见单细胞非腺毛；叶肉为异面叶型，栅栏细胞1～3列，短柱状，呈橙黄色,排列较整齐，不通过主脉，海绵组织疏松，细胞内含草酸钙方晶和簇晶；主脉向下突出，维管束外韧型，环状，外围有纤维束，其周围薄壁细胞含草酸钙方晶和簇晶，形成晶纤维(见图5～6)。粉末：棕绿色至黄绿色，上表皮细胞多角形、狭长形或方形；下表皮有多数单细胞非腺毛，常弯曲，长130～800 μm，气孔不定式，保卫细胞直径3～13 μm，副卫细胞4～8个；草酸钙簇晶散在薄壁组织中，直径为2～29 μm；草酸钙方晶的直径为2～24 μm；纤维成束，周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维；导管为梯纹或螺纹，直径2～20 μm。见图7。

1.上表皮 2.栅栏细胞 3.木质部 4.海绵组织 5.下表皮 6.非腺毛 7.韧皮部 8.纤维 9.皮层

1.非腺毛 2.木质部 3.上表皮细胞 4.栅栏组织 5.海绵组织 6.下表皮 7.韧皮部 8.纤维 9.皮层

1.非腺毛 2.上表皮细胞 3.下表皮细胞及气孔 4.晶纤维 5.簇晶 6.方晶 7.螺纹导管 8.梯纹导管

2.2.2 薄层鉴别

根据《四川藏药材标准》(2014年版)俄色叶项下的薄层鉴别方法，取根皮素适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。以硅胶G薄层板为吸附板，以氯仿-甲醇-甲酸(8∶2∶0.1)为展开剂，以三氯化铝试液为显色剂。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同浅蓝色荧光斑点。见图8。

注：1～8为净制俄色叶；9～15为切制俄色叶；S为根皮素对照品

2.3 检查

2.3.1 水分

称取俄色叶饮片粉末约2.0 g，照《中国药典》2015年版(四部)通则0832项下水分测定法第二法进行测定。结果表明，15批净制饮片水分为6.88%～10.16%，平均为9.05%；切制饮片测定结果为7.01%～10.23%，平均为9.11%。详见表2～3。

表3 切制饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物测定结果 n=3，%

2.3.2 灰分

称取俄色叶饮片粉末约4.0 g，按照《中国药典》2015年版(四部)通则2302灰分测定法进行总灰分和酸不溶性灰分的测定。结果表明，净制饮片总灰分为5.24%～6.37%，平均为5.80%；切制饮片为5.33%～6.17%，平均为5.82%。净制饮片酸不溶性灰分为0.36%～0.48%，平均为0.42%；切制饮片为0.33%～0.47%，平均为0.42%。详见表2～3。

2.4 浸出物

称取俄色叶饮片粉末约2.0 g，精密称定，按照《中国药典》2015年版(四部)通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用80%乙醇作溶剂。结果表明，净制饮片浸出物为41.08%～44.49%，平均为43.02%；切制饮片测定结果为41.67%～43.92%，平均为42.72%。详见表2～3。

2.5 含量测定

2.5.1 总黄酮含量测定

参照《四川省藏药材标准》(2014年版)俄色叶总黄酮测定方法进行测定，总黄酮含量以根皮苷计。结果表明，净制饮片总黄酮含量为20.64%～25.95%，平均为22.93%，切制饮片总黄酮含量为20.77%～24.97%，平均为22.69%。详见表4。

2.5.2 根皮素

参照《四川省藏药材标准》(2014年版)中俄色叶根皮素测定方法进行测定。结果表明，15批净制饮片根皮素含量为0.170%～0.503%，平均为0.234%；切制饮片中根皮素含量为0.171%～0.498%，平均为0.229%。详见表4。

表4 俄色叶饮片含量测定结果 n=3，%

2.6 工艺研究

2.6.1 俄色叶炮制方法对质量的影响

依据《中华人民共和国药典》(2015年版)和《四川省中药饮片炮制规范》(2015年版)对饮片净制工艺的相关要求，以及目前饮片生产企业对于俄色叶净制的操作与要求，取干燥的俄色叶药材分别进行净制和切制的处理。将净制俄色叶和切制俄色叶各5批分别进行水分、总灰分、浸出物、总黄酮、根皮素含量测定，观察俄色叶炮制方法对其质量的影响。结果表明，切制俄色叶较净制饮片水分略有升高，总灰分、浸出物、总黄酮和根皮素均略有降低，对酸不溶性灰分无影响。详见表5。

表5 不同炮制方法对俄色叶饮片质量的影响 %

2.7 稳定性实验

取模拟上市包装的净制俄色叶和切制俄色叶中试样品各3批(批号：170101、170102、170103、170101q、170102q、170103q)进行加速试验和长期试验考察。

2.7.1 加速试验

取模拟上市包装的俄色叶和切制俄色叶中试样品各3批，置于温度(40±2)℃，湿度(75±5)%的恒温恒湿培养箱中进行贮藏，在0，1，2，3，6个月取样，对饮片的性状进行观察，并测定水分、浸出物、总黄酮以及根皮素含量。2种饮片共6批样品经6个月考察发现，水分、总黄酮及根皮素含量无明显变化，符合质量标准要求，浸出物从第2月开始出现明显较低的现象，到第6月时，两种饮片浸出物的损失率分别达15.1%和14.05%，但均符合质量标准要求。详见图9。

注：1.水分 2.浸出物 3.总黄酮 4.根皮素

2.7.2 长期试验

取上市包装的净制饮片和切制饮片各3批，置于室温(25±2)℃，湿度(60±5)%的条件下贮藏，在0，1，2，3，6，12，18，24个月进行取样，对饮片的性状进行观察，并测定水分、浸出物、总黄酮以及根皮素含量。2种饮片共6批样品经24个月考察发现，水分、浸出物、总黄酮及根皮素含量均符合质量要求，到第24月时，两种饮片浸出物的损失率分别达12.94%和14.02%，但均符合质量标准要求。详见图10。

注：1.水分 2.浸出物 3.总黄酮 4.根皮素

3 结论

本文通过对俄色叶饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、总黄酮含量以及根皮素含量进行研究，根据各项检测结果，拟定俄色叶饮片水分不得过11.0%，总灰分不得过7.0 %，酸不溶性灰分不得过0.5%，浸出物不得少于34.0 %。按干燥品计算，总黄酮以根皮苷(C21H24O10)计，不得少于18.0%，根皮素(C15H14O5)含量不得少于0.18%。

4 讨论

饮片是中药配方颗粒、中药汤剂、中成药的直接原料药，其质量的好坏直接影响到三大产品的质量。因此，饮片的质量控制显得至关重要。

俄色叶芽与俄色大叶的根皮素含量差异较大，研究发现俄色叶芽根皮素含量较大叶高，尤以5月份初生的叶芽根皮素含量最高，均值可达1.516%，而大叶根皮素含量平均仅为0.218%，二者均值差异达近7倍。《四川省藏药材标准》(2014年版)俄色叶标准中规定根皮素含量不得少于0.35%，但在实际生产中发现，约60%的俄色叶药材根皮素含量低于0.35%，这些含量较低的俄色叶中约97%的样品为俄色大叶。根据调查发现，“俄色树”每年5月开始抽出叶芽，因叶芽采摘难度大，量比较小，且十分昂贵，因此常被制作成茶叶进行销售。而当6～8月份时，叶芽较少，主要采集俄色大叶，以作药用。因此俄色叶药材资源以6～8月份采摘的俄色大叶为主。为保证俄色叶资源的有效利用，故拟定俄色叶净制和切制饮片的根皮素含量均不得少于0.18 %。

加工炮制中净选是确保中药质量和临床用药准确性的一个首要环节，而切制是便于包装、促进有效成分溶出的一种重要手段。通过挑除俄色叶药材中所混的枝梢、枯叶、枝梗等杂质，提高药材的品质，形成净制俄色叶饮片；取用净制后的俄色叶切碎、包装，形成切制俄色叶饮片。通过分析两种炮制方式对俄色叶饮片质量和成品率的影响，评价炮制方式是否合适。

根据加速试验和长期试验的结果，净制俄色叶和切制俄色叶的外观性状及水分、总黄酮以及根皮素含量无明显变化，各项指标均符合其质量标准，说明这两种饮片在常温条件下质量稳定，在常温条件下可贮藏24个月。

本文首次对不同基原、不同批次的两种俄色叶饮片从外观性状、显微特征、薄层色谱、水分、灰分、浸出物、总黄酮以及根皮素含量等进行了研究，拟定了俄色叶饮片质量控制指标，为俄色叶饮片质量标准的制定奠定了基础，能够有效保障俄色叶饮片质量的稳定、可控，同时也为俄色资源的进一步开发利用提供了科学支撑。