椒目仁油微波-超声辅助提取工艺优化及降血脂活性研究

年婧，景军强 ，赵重博 ，辛玲歌，翟夏▲，孙静

(1.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000；2.陕西一方平康制药有限公司，陕西 咸阳 712046；3.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

椒目Zanthoxyli Semen为芸香科植物花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.和青椒ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.的干燥成熟种子，由于青椒产地分布狭窄，其种子未形成商品规模，故商品椒目多为花椒的干燥成熟种子[1]。椒目始载于《本草经集注》，《本草纲目》记载其“下达，能通渗道，不行谷道，所以能下水燥湿，定喘消胀也”，临床上多用于水肿胀满，痰饮喘逆症。现代药理研究表明椒目对高脂血症有较大治疗潜力，对小鼠、家兔以及细胞层面都表现出良好的改善血脂作用[2-5]。椒目中的化学成分主要为脂肪酸、挥发油及氨基酸，其中椒目皮油主要含棕榈酸、棕榈油酸、油酸和亚油酸，椒目仁油主要含亚麻酸，其中不饱和酸含量在90 %以上。椒目仁油所含主要成分α-亚麻酸具有多种活性，如抑制血栓形成、预防老年痴呆、防治过敏性哮喘和降血脂等[6-8]，已有的研究显示椒目仁油可以改善血液中的脂质分布，同时通过蛋白激酶A途径磷酸化引起活化激素敏感脂肪酶(Hormone-Sensitive Lipase)降解细胞脂质，最终导致脂肪分解，起到改善血脂水平的作用[2,9-10]。因此椒目仁油在保健品研发方面有很广阔的发展前景。

Plackett-Burman设计可以筛选出对实验结果影响显著的因素，Box-Behnken效应面法具有实验精度高的特点，两者结合在工艺优化研究中被广泛使用[11-12]。目前椒目仁油提取广泛采用压榨技术、索氏回流提取、超临界CO2流体萃取等[13-15]。超声可以有效地破坏种子的细胞壁，微波具有优秀的穿透性，加热效率非常高，这两种技术也常配合应用于植物油提取中[16-17]。本次实验使用超声-微波联用萃取仪优化椒目仁油提取工艺，同时采用高脂饮食建立大鼠高脂血模型评价所提取的椒目仁油降血脂作用，以期为椒目的开发应用提供依据和参考。

1 实验材料

1.1 实验材料

椒目药材购自陕西省韩城市芝阳花椒市场(批号：20191003)；α-亚麻酸(中国食品药品检定研究院，纯度>99.0%，批号：111631-200502)；十四酸(上海振谱生物有限公司，纯度>99.5%，批号：180715)；阿托伐他汀钙胶囊(天方药业有限公司，批号：H20181108)；正己烷、氢氧化钾、氢氧化钠等均为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；实验用水为纯化水。

1.2 仪器

SCIENTZ-IIDM微波光波超声波萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，磁力搅拌转子离心半径r=1.4 cm)；TG台式离心机(四川蜀科仪器有限公司)；RE-52C型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；BT25S型分析天平(赛多利斯上海贸易有限公司)；7890A气相色谱仪配电子捕获检测器-MS 5977B(美国安捷伦公司)；TC、TG、HDL-C、LDL-C试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200728，20200702，20200921，20200613)；TBA-40FR全自动生化分析仪(日本东芝株式会社)。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，72只，雌雄各半，体质量160～180 g，购于西安交通大学医学动物实验中心，许可证号为SCXK(陕)2014-003，饲养和实验操作均符合动物实验管理条例的要求。MD12032动物高脂饲料和普通饲料(江苏美迪森生物医药有限公司)。

2 实验方法

2.1 椒目仁油中α-亚麻酸含量测定

2.1.1 色谱条件

参考文献条件[18-19]，使用PEG-20M毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.5μm)，柱温：190℃，进样口温度：250℃，检测器温度：250℃；载气：氮气(99.99%)；燃气：氢气，40 mL/min，空气,400 mL/min；进样量：5μL，分流比：25∶1。

2.1.2 内标溶液的制备

精密称定十四酸10 mg，置具塞锥形瓶中，加入 0.5 mol/L 氢氧化钾-甲醇溶液 1 mL，于 60℃水浴加热 30 min，取出，放冷。加入 14%三氟化硼-甲醇溶液 1 mL，于 60℃水浴加热 20 min，取出，放冷。精密加入正己烷10 mL，充分振摇，加入饱和氯化钠溶液 15 mL，摇匀，静置。精密移取上层续滤液，定容至25 mL容量瓶，作为内标溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

称取椒目药材100 g，加适量1.4%NaOH水溶液，60℃搅拌30 min除去表面油脂[20]。取适量残渣打粗粉，置提取瓶中，加入10倍正己烷，设置微波-超声波萃取仪参数：微波功率300 W，微波时间120 s，超声功率300 W ，超声10 min，转速100 r/m。提取完成后离心过滤，滤液减压回收正己烷，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上低温蒸干，于干燥器中干燥24 h，即得椒目仁油固形物。(椒目仁油含油率=椒目仁油固形物质量/椒目药材质量×100%)

取上一步制备所得的椒目仁油固形物100 mg，加入内标十四酸10 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，照“2.1.2”项下十四酸溶液的方法配制，作为供试品溶液。

2.1.4 线性关系考察

分别精密取α-亚麻酸对照品10 mg，20 mg，30 mg，40 mg，50 mg，均加十四酸10 mg，置具塞锥形瓶中，照“2.1.2”项下十四酸溶液的方法配制，作为不同浓度标准品溶液。采用气相色谱仪自动进样，分别测定不同浓度对照品溶液中十四酸和α-亚麻酸峰面积，计算其比值，以十四酸和α-亚麻酸峰比值为纵坐标，以α-亚麻酸浓度为横坐标，计算线性关系。

2.1.5 方法学研究

将加入内标的对照品溶液重复进样6次，以α-亚麻酸峰面积与十四酸峰面积比值计算精密度RSD值；取6份100 mg椒目仁油分别加十四酸10 mg照“2.1.2”项下方法制备样品，以α-亚麻酸峰面积与十四酸峰面积比值计算重复性RSD值；同一样品分别在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h设置进样，以α-亚麻酸峰面积与十四酸峰面积比值计算样品稳定性RSD值；取50 mg椒目仁油6份加10 mg十四酸和适量α-亚麻酸对照品照“2.1.2”项下方法制备样品进样，以α-亚麻酸峰面积与十四酸峰面积比值计算平均加样回收率及RSD值。

2.2 Plackett-Burman设计

在预实验基础上，运用Design-Expert软件的Plackett-Burman模块，选择粉碎粒径50～80目，料液比6～10倍，微波功率300～500 W，微波时间60～120 s，超声功率200～400 W，超声时间6～12 min，搅拌速度60～120 r/m，考察各因素对椒目仁油提取率和α-亚麻酸含量综合评分的影响，采用总评归一值法[21][利用Hassan 法对各效应值进行归一化，本次实验的椒目仁油提取率和化学成分含量越高越好，因此，归一值di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，再对归一值求几何平均值，OD=(d1，d2，…，dn)1/n] 研究各因素对实验结果的影响差异。

2.3 Box-Behnken效应面法优选

在单因素试验和PB实验的基础上，以椒目仁油提取率和α-亚麻酸含量OD值为自变量，以微波功率、微波时间和超声功率为因变量，根据Design Expert软件的Box-Benhnken 中心组合试验模块进行实验设计，优选椒目仁油的最佳提取工艺。

2.4 提取工艺参数验证

根据实际条件的可操作性，按照优化工艺条件提取3次椒目仁油，并与BBD实验的预测结果进行比较。

2.5 椒目仁油降血脂作用研究

2.5.1 实验分组及给药[22]

大鼠适应性喂养一周后，随机分为6组，每组12只，分别为空白对照组，模型组、阳性对照组、椒目仁油高剂量组、中剂量组、低剂量组。除正常对照组外其余五组大鼠用高脂饲料喂养，正常对照组给予普通饲料。饲养4周后确认造模成功，保证每组大鼠10只，开始给药。对照组和模型组灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃7.5 mg/kg的阿托伐他汀胶囊内容物，给药组依次给予椒目仁油100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg，给药剂量参考文献[2-4]，每天一次，连续4周。给药4周后即实验第8周进行指标检测。

2.5.2 样本采集

喂养4周后，禁食过夜，眼眶取血1.5 mL，室温下静置1 h，3 500 r/min(4 375×g)离心10 min 后取出上清液，按试剂盒要求对血清进行处理，分别测定血清中TC、TG、HDL-C 及LDL-C 的水平，确定造模成功后，弃除不符合要求大鼠。

末次给药后，禁食12 h (饮水不限)，眼眶取血1.5 mL，同上法处理，测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。

2.5.3 统计学分析

3 结果

3.1 椒目仁油中α-亚麻酸含量测定

十四酸、α-亚麻酸和椒目仁油样品的气相色谱图见图1，内标和样品中色谱峰不存在干扰。以α-亚麻酸峰面积与十四酸峰面积比值为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，得回归方程Y=103.27X+0.0478(R2=0.998 6)，表明α-亚麻酸质量浓度在0.008～0.04 mg/mL呈良好线性关系。精密度RSD为0.24%；重复性RSD为1.12%；24 h内稳定性RSD为1.07%；平均加样回收率为98.97%，RSD为0.84%。

图1 椒目仁油样品气相色谱图

3.2 Plackett-Burman设计优选结果

运用Design-Expert软件的Plackett-Burman模块对因素水平(-1、1)设计实验方案，实验方案及结果见表1和表2。

表1 PB实验因素水平表

表2 PB实验设计及结果

对利用Design-Expert软件对实验因素和结果进行方差分析，对模型采用F检验进行方差分析及模型系数显著性检查，结果见表3。

表3 PB实验方差分析结果

由表3 可以看出，所建立的模型具有统计学意义(P<0.01)，表明该模型可用于椒目提取因素的分析。其中微波功率对椒目仁油提取率和α-亚麻酸含量影响有统计学意义(P<0.01)，微波时间和超声功率的影响也具有统计学意义(P<0.05)，故将此3个因素作为下一步响应面法优化的因素。粉碎粒径、浸泡温度、浸泡时间、超声温度对实验结果影响不大，因此结合单因素实验结果选择椒目粉碎粒径65目，加8倍量正己烷，超声时间9 min，转速90 r/m作为进一步实验条件。

3.3 Box-Behnken效应面法优选结果

BBD实验设计方案及实验结果见表4和表5。

表4 因素水平表

表5 BBD实验设计表与效应值

对星点设计实验结果运用Design-Expert软件进行响应面分析，以椒目提取OD值为响应值，对微波功率、微波时间和超声功率进行多元线性回归二项式方程拟合，拟合的方程模型为OD=-10.82+0.052×微波功率+0.019×微波时间+0.000 50×超声功率-0.000 1×微波功率×微波时间-0.000 000 30×微波功率×超声功率+0.000 002 0×微波时间×超声功率-0.000 006 0×微波功率2-0.000 01×微波时间2-0.000 000 90×超声功率2(R2=0.997 6；RAdj2=0.994 4)，对模型采用F检验进行方差分析及模型系数检查，结果见表6。二项式模型P<0.000 1，说明该方程与实际情况拟合良好，可用此模型和方程来分析预测最佳提取工艺条件，OD值提取率与任意2个因素的三维效应面曲线见图2。以OD值最大值为目标，根据“Design Expert 8.05 b”实验设计软件得最佳椒目仁油提取工艺参数为：粉碎粒径65目，8倍量正己烷，微波功率392.01 W处理82.94 s，超声功率297.01 W处理9 min，转速90 r/m，OD值预测最大值0.999 5。

表6 实验方差分析结果

3.4 提取工艺参数验证

根据实际条件的可操作性，将工艺条件优化为：椒目药材粉碎粒径65目,8倍量正己烷，微波功率392 W处理83 s，超声功率297 W处理9 min，转速90 r/m，结果见表7。椒目仁油平均提取率为17.41%，α-亚麻酸含量为32.05%，平均OD值为1.069 0，接近且大于预测值，说明模型预测性良好。

表7 验证试验结果

3.5 椒目仁油对高脂血模型大鼠影响结果

造模4周，与正常组比较，造模大鼠血清TC、TG、LDL-C 均升高(P<0.01)，HDL-C降低(P<0.01)，说明模型复制成功，且治疗组与模型组之间差异无统计学意义。造模后再给药4周，椒目仁油高中低剂量组均在一定程度上回调各项指标。其中高剂量组椒目仁油对高脂血模型大鼠的改变最明显(P<0.01，P<0.05)，中剂量组对TC、TG和LDL-C三个指标作用明确(P<0.01，P<0.05)，低剂量组对TC和TG指标作用明确(P<0.01)，对HDL-C和LDL-C有所回调，但是与模型组比较差异没有统计学意义。说明椒目仁油对高脂血症大鼠有明显的降血脂作用，并呈现一定的量效关系，浓度在300 mg/kg时作用明显(见表8)。

表8 大鼠血脂测定结果

4 讨论

椒目仁油含有大量的不饱和脂肪酸，如油酸和亚麻酸，KimKyoung Kon[2]等人实验结果显示椒目油可以改善血液中的脂质分布、降解细胞脂质，最终导致脂肪分解，达到改善血脂水平的目的。肖会敏[4]等人实验结果显示椒目仁油降血脂的作用主要依赖其中不饱和脂肪酸即α-亚麻酸,其降血脂的效果随着椒目仁油剂量的增加而加强,同时随着使用时间的延长而加强。

图2 椒目仁油提取各因素对响应值的等高线和效应面图

目前椒目仁油(花椒籽油)的提取方法主要采用压榨技术、索氏回流提取、超临界萃取法、水酶法等，刘通等采用超临界萃取经碱皂化后的花椒籽得油率为19.98%[23]，吴珺婷等采用纤维素酶和中性蛋白酶水相酶解及正己烷萃取花椒籽得油率为11.2%[24]，李霞等采用微波辅助优化脱蜡花椒籽得油率为18.68%[25]，徐文秀等采用超声辅助优化脱蜡花椒籽得油最优得率为27.25%[26]。本实验通过微波-超声同时提取研究椒目仁油的最优提取工艺，相比常规的提取方法有着溶剂使用量少，提取时间短以及提取效率高等优点。因为微波会瞬间穿透物料内部快速加热，但是要保证合适的功率和加热时间，否则会导致中药热敏性成分发生变化，超声则会增加溶液中分子的相对运动频率。椒目药材粉碎粒径越小，表面积越大，提取效率越高，但是当粒径过于细小，容易与油粘结成团，不利于团块内部的成分的溶出。本研究优化的超声-微波联用工艺相比单独的超声提取工艺实现了椒目仁油提取率为17.41%，α-亚麻酸的含量为32.05%，若按经NaOH水溶液皂化后重量计(100 g椒目处理后得干燥残渣约78.21 g)本研究最终椒目仁得油率为22.32%。相比已有文献报道，本研究所得椒目仁油的得率并不是最高，与研究对象椒目自身的含油率及是否已经经过脱蜡工艺有关。

实验制备所得椒目仁油能明显降低大鼠血脂中TC、TG、LDL-C 水平，升高HDL-C 水平，改善血脂代谢，其中高剂量椒目仁油干预效果接近阳性对照药阿托伐他汀。研究结果为椒目的综合开发利用提供了一定的借鉴。