不同部位输精对绵羊胚胎移植中供体冲胚效果的影响

李心海，高 峰*，王 岩

（1.徐州生物工程职业技术学院，江苏 徐州 221000；2.江苏汉羊牧业生态科技有限公司，江苏 徐州 221000）

近年来，羊胚胎移植已在生产中推广应用，尤其在引种和扩繁等方面发挥着重要作用。在对供体羊进行人工授精时，应因地制宜，结合当地生产条件。一般常用冻精和鲜精进行人工授精，阴道授精、子宫颈口授精较为常见，利用腹腔镜进行子宫角、输卵管授精很少见。因为阴道授精、子宫颈口授精操作简便，不需要特殊器材设备，常规操作即可完成，而子宫角、输卵管授精所需设备较多，价格不菲。此外，阴道授精、子宫颈口授精不需要对动物做手术，而子宫角、输卵管授精需要做手术，操作要求高，非专业人员无法完成。用冻精和鲜精对绵羊胚胎移植中供体进行授精，会对供体所冲出的胚胎产生影响；采取不同部位输精对绵羊胚胎移植中供体进行授精，也会对供体所冲出的胚胎产生影响。为了选出最佳方案，使绵羊胚胎移植技术更加成熟，进行本次试验。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 2020年4月在江苏汉羊牧业生态科技有限公司养羊场选取160只约2岁龄、身体健康的母湖羊。试验前，B超检查母羊是否怀孕，15 d后再检查1次。母羊按组饲养，严格与公羊隔离。选取身体健康、体格健壮的种公羊采集鲜精。

1.1.2 试验药品与仪器 试验药品包括羊用阴道栓（CIDR，南非ZOETIS公司，每包20支，每支含0.3 g孕酮）、兽用孕马血清（PMSG，宁波三生生物科技有限公司，1 000 IU/瓶）、促卵泡素（FSH，宁波三生生物科技有限公司，100 IU/瓶，4℃条件下保存）等，绵羊冻精购自徐州市家畜良种站。

试验仪器包括冲胚管、母羊保定台、恒温水浴锅、腹腔内窥镜，体视显微镜、开膣器、子宫钳、集精杯、手术剪、医用喷壶、止血钳、注射器、液氮罐、培养皿、手术刀片、手术架、医用缝合线、留置针、镊子、记号笔等。

1.2 试验方法

1.2.1 饲养管理 试验绵羊以组为单位分栏舍饲。供体羊日粮配方为青贮玉米2.3 kg、干草1.0 kg、玉米0.23 kg、麸皮0.21 kg、豆粕0.16 kg、胡萝卜0.6 kg。每天上午8点、下午5点各饲喂1次，置自动饮水器饮水，羊自由舔食。种公羊加饲胡萝卜和鸡蛋，正常采精鲜精，并检查精液品质。

1.2.2 供体羊的处理 采用FSH+PMSG+PG法。在湖羊阴道内埋植阴道栓，并记为第1天，在第11天下午肌注FSH，每隔12小时注射1次，连续注射7次。在第5次注射时，肌肉注射PMSG 200 IU/只。第14天取出阴道栓。

将母羊随机分为8组，每组10只，冻精组分为Ⅰ组（阴道授精）、Ⅱ组（子宫颈口授精）、Ⅲ组（子宫角授精）、IV组（输卵管授精）；鲜精组分为Ⅰ组（阴道授精）、Ⅱ组（子宫颈口授精）、Ⅲ组（子宫角授精）、IV组（输卵管授精）。

1.2.3 人工授精

1.2.3.1 阴道授精。取栓后第2天对绵羊试情，对发情绵羊阴道输精，每隔12小时进行1次输精，一直到发情结束，输精次数不少于3次。输精时，将母湖羊倒立保定，清洗阴门周围并消毒，用开膣器打开阴道，将输精枪插到阴道底部输入精液。

1.2.3.2 子宫颈口。取栓后第2天对绵羊试情，对发情绵羊于子宫颈口输精，每隔12小时进行1次输精，一直到发情结束，输精次数不少于3次。输精时，将母湖羊倒立保定，清洗阴门周围并消毒，用开膣器将阴道打开，将输精枪深入子宫颈口1.0～2.0 cm将精液输入，授精完成后，在母羊股部拍击一下，促进子宫颈收缩，避免精液流出影响授精效果。

1.2.3.3 子宫角授精。撤栓后48 h进行授精。授精前母湖羊禁食24 h，清理术部，将乳头附近被毛剃除，碘酊、酒精先后消毒，在乳房附近一侧用手术刀作1.0～2.0 cm纵行切口，将内窥镜伸入腹腔内，寻找子宫角及卵巢，察看卵巢上红体状况；在另一侧乳房对称部位再用手术刀切一纵行切口，使用子宫钳固定子宫角，用自制输精枪刺破靠近输卵管的子宫角壁输精。将手术器械一一取出，缝合腹壁，肌肉注射青链霉素，授精完成。

1.2.3.4 输卵管授精。操作同子宫角授精，将子宫角用子宫钳拉出腹腔，找到输卵管，用回形针刺破输卵管壁，用输精枪注入精液。再用同样的方法向另一侧输卵管内注入精液，后将子宫角、输卵管放入腹腔，缝合腹壁，肌肉注射青链霉素，授精完成。

1.2.4 授精后的管理 对母羊饲喂营养丰富的日粮，密切注意母羊状态，避免外来刺激。

1.3 胚胎的采集

授精后第6天对供体湖羊采卵。手术前对供体湖羊肌肉注射陆眠宁1 ml/只。在靠近乳房的腹部作一纵行切口，用食指和中指夹住子宫角并拉出腹腔外，用生理盐水冲洗一下，用灭菌的回形针刺破子宫角壁，并从此处插入套管针，将针芯抽出，再用回形针刺破子宫角另一端，并在此处插入冲胚管。用注射器向冲胚管内注入适量水，能够将子宫角撑开，但不能将子宫角壁撑破，在冲胚管的另一端用集卵皿收集胚胎。用注射器吸取生理盐水从套管处注入进行冲胚，并在冲胚管的末端收集冲胚液，然后用注射器将水囊的水抽完，从子宫角抽出冲胚管，冲洗子宫并放回腹腔，缝合腹壁，手术完成后肌肉注射陆醒宁1 ml，并肌肉注射青链霉素以防发生感染。

1.4 检胚

将冲胚液静置10 min，在室温下用实体显微镜放大20倍检胚。先用吸管吸取上清液并弃掉，再用吸管将胚胎转移至另一培养皿中，反复寻找胚胎，将所有胚胎检出。

1.5 胚胎检查

体视显微镜放大20～30倍检查胚胎的大小、色调、形态、均匀度、分裂程度、透明带等，并对胚胎进行质量分级。A级：形态完整，卵裂球均匀对称，无碎片，细胞紧凑、光滑，透明带正常；B级：形态完整，卵裂球轻微不对称，15%碎片，透明带正常；C级：卵裂球不对称，30%碎片，胚胎轮廓粗糙、结构松散，卵裂球间有大液泡，色调暗淡，游离细胞多；D级：胚胎未受精，细胞变性，出现较多碎片，胚胎发生退化。

1.6 计算胚胎受精率与胚胎正常发育率

胚胎受精率=受精胚胎数/冲出胚胎数×100%（1）可用胚胎率=可用胚胎/受精胚胎数×100%（2）

1.7 数据处理

用Excel 2003软件记录试验数据并进行整理，用SAS软件中的PROC FREQ程序进行数据分析。

2 结果

2.1 冻精液对供体母羊冲胚的影响

由表1可知，用冻精液对供体母羊不同部位授精，对供体母羊冲胚有明显影响。母羊阴道授精、子宫颈口授精、子宫角授精、输卵管授精冲出胚胎数分别为131枚、128枚、133枚、126枚；受精胚胎数分别为31枚、37枚、82枚、74枚，受精率分别为23.67%、28.90%、61.65%、58.73%。冻精I组、II组与冻精Ⅲ组、IV组之间具有显著性差异（P＜0.05）。受精胚胎中能正常使用的A、B级胚胎分别为18枚、22枚、58枚、53枚；冻精Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、IV组的胚胎可用率分别为58.06%、59.46%、70.73%、71.62%，冻精I组、II组与冻精Ⅲ组、IV组之间具有显著性差异（P＜0.05）。

表1 冻精液对供体母羊冲胚的影响

2.2 鲜精液对供体母羊冲胚的影响

由表2可知，用鲜精对供体母羊不同部位输精，对供体母羊冲胚有明显影响。母羊阴道授精、子宫颈口授精、子宫角授精、输卵管授精冲出胚胎数分别为127枚、131枚、129枚、133枚；受精胚胎数分别为92枚、111枚、121枚、124枚，受精率分别为72.44%、84.73%、93.80%、93.23%。鲜精I组、II组与鲜精Ⅲ组、IV组之间具有显著性差异（P＜0.05）。受精胚胎中能正常使用的A、B级胚胎分别为71枚、86枚、105枚、100枚。正常发育胚胎见图1。鲜精Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、IV组的正常发育胚胎率分别为77.17%、77.48%、86.78%、80.65%，组间显著性差异不明显（P＞0.05）。

表2 鲜精液对供体母羊冲胚的影响

图1 正常发育胚胎

3 讨论

3.1 冻精进行不同部位输精对绵羊胚胎移植中供体冲胚会产生影响

使用冻精进行不同部位输精会对绵羊胚胎移植中供体冲胚产生影响。阴道、子宫颈口、子宫角、输卵管授精冲出胚胎受精率分别为23.67%、28.90%、61.65%、58.73%，说明冻精通过阴道、子宫颈口、子宫角到达输卵管的过程中，有很多冻精没有到达输卵管，或到达输卵管也没有受精能力，无法与卵子相结合。从子宫角、输卵管输入的精子没有经过阴道、子宫颈口这样漫长的过程，到达输卵管所用时间相对较短，死亡的精子相对较少，具有受精能力的精子数量比冻精Ⅰ组、Ⅱ组多，所以胚胎受精率高，且两者受精率不存在显著性差异，说明使用冻精在子宫角、输卵管处授精均可。在冻精生产过程中，因加入了很多化学药剂，且其在液氮中保存时间较长，在使用时进行解冻，这些精子会受到各种因素的影响。使用前精子的活力保持0.3即为合格，能够进行授精，解冻后应立即输精。

冻精Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、IV组的胚胎可用率分别为58.06%、59.46%、70.73%、71.62%。说明冻精通过阴道、子宫颈口、子宫角到达输卵管后，部分精子的受精能力降低，即使与卵子结合成功，受精卵的分裂可能会不正常。

3.2 鲜精进行不同部位输精对绵羊胚胎移植中供体冲胚产生的影响

用鲜精从阴道、子宫颈口、子宫角、输卵管授精，供体冲出胚胎的受精率分别为72.44%、84.73%、93.80%、93.23%，鲜精I组、II组与鲜精Ⅲ组、IV组之间具有显著性差异（P＜0.05）。说明用鲜精从不同部位输精受精率都不低，这是因为鲜精活力高，即使在阴道、子宫颈口处授精，大多数精子依然可以通过漫长的过程成功到达输卵管与卵子相结合。在子宫角、输卵管处授精，胚胎受精率较高，因为此处授精的精子没有经过漫长的过程，受精能力强。鲜精Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、IV组的可用胚胎率分别为77.17%、77.48%、86.78%、80.65%，组间显著性差异不明显（P＞0.05）。说明经过各种途径授精的鲜精与卵子结合后，对胚胎的分裂产生的影响不明显。

将鲜精Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、IV组分别与冻精Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、IV组对比发现，使用鲜精在任何部位的输精效果远远大于冻精的输精效果。说明鲜精的受精能力远远强于冻精。因此在胚胎移植过程中，不易使用冻精；为了保证授精效果、胚胎的质量，在胚胎移植实践中应使用鲜精。

3.3 子宫角、输卵管授精效果的比较

试验结果表明：子宫角、输卵管授精，胚胎受精率、可用胚胎率均高，但二者在实践中存在三方面差别。一是输卵管不如子宫角容易找到，输卵管太细小，不易发现，操作中往往要花费较多时间才能找到；子宫角粗大，找到子宫即找到子宫角。二是输精操作的难易程度不同，输精前要刺透输卵管壁或子宫角壁，输卵管壁不易刺透，有可能会将整个输卵管刺穿，而子宫角壁很容易被刺透。三是对供体羊机体的健康影响不同，刺透输卵管壁容易发生粘连；刺透子宫角壁不容易发生粘连，不影响下次使用。此外，输卵管处授精比子宫角处授精的受精率还要低一点。因此，推荐在子宫角处进行人工授精。

卢小芳等[1]在做超数排卵试验时，将精液注入供体羊子宫内，结果所冲出的胚胎受精率超89%。苏和等[2]将精液分别输到供体母羊子宫颈和子宫内，结果可见，采用子宫颈授精，所获胚胎受精率为79.33%，采用子宫角授精，所获胚胎受精率为92.71%。柴孟龙等[3]在超排试验中对供体羊进行子宫内以及子宫颈人工授精，结果发现子宫内输精冲出的胚胎受精率为94.62%，子宫颈授精冲出的胚胎受精率为85.48%。董志岷等[4]在超排试验时对供体羊进行子宫内人工授精，所采胚胎受精率超96%。王玉琴[5]等用腹腔镜技术对绵羊子宫角进行输精，发现胚胎受精率为100%；采取子宫颈授精的绵羊所冲胚胎受精率为77.38%。以上研究说明子宫内授精效果显著高于子宫颈授精，这与本次试验研究结果具有一致性。

4 小结

用鲜精从阴道、子宫颈口、子宫角、输卵管授精，供体冲出胚胎的受精率分别为72.44%、84.73%、93.80%、93.23%，鲜精I组、II组与鲜精Ⅲ组、IV组之间具有显著性差异（P＜0.05），且各鲜精组明显高于相应的冻精组。鲜精Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、IV组的可用胚胎率分别为77.17%、77.48%、86.78%、80.65%，组间显著性差异不明显（P＞0.05），且各鲜精组明显高于相应的冻精组。因此，在绵羊胚胎移植中对供体应使用鲜精进行输精，应采用子宫角授精，冲胚效果最好。