西藏牦牛多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏分析

王玉恒，吉哈利，彭燕娟，索朗卓嘎，于子淇，邓 愧，周海娟，其美央宗，丹真次旦，包玉花*

（1.西藏自治区兽医生物药品制造厂，西藏 拉萨 850000；2.西藏莲茎生物科技有限公司，西藏 拉萨 850000）

牦牛主要生活在西藏高海拔地区，具有耐严寒、耐疲劳、善于走陡坡险路等优点，对西藏畜牧业发展具有重要作用[1]。近年来，牦牛的细菌病感染率、死亡率逐渐增加，已严重影响到牦牛健康及养殖户经济收入。因此，研究牦牛细菌性传染病非常必要。

多杀性巴氏杆菌是一种两端钝圆、中央微凸的革兰氏阴性短杆菌，能引起牛、羊、鸡、兔等多种动物患急性败血型、炎性出血型等症状为主的传染病。该病主要以呼吸道、消化道、皮肤黏膜损伤及吸血蚊虫叮咬等方式传播。截至目前，对多杀性巴氏杆菌分离鉴定、诊断、治疗以及防控的研究越来越多[2-4]。如1954年廖延雄[5]首次研究了牦牛多杀性巴氏杆菌的培养特性及生化特性；1979年郭大和等[6]从我国水牛、黄牛组织中分离出了多杀性巴氏杆菌，经鉴定均为B型；1985年肖克宇等[7]发现了培养多杀性巴氏杆菌的新方法；1995年魏天文等[8]研究了一种检测实验动物的多杀性巴氏杆菌的ELISA竞争抑制法；2001年Townsend等[9]根据Pm荚膜编码基因设计特异性引物，建立了一套分子生物学的鉴定及分型方法；2016年李春生等[10]研究了青海牦牛A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定；2018年蔡其刚等[11]研究了牦牛出血性败血症的病原分离及鉴定；2019年阚威等[12]在青海病死牛组织中分离出了4株病原菌，并鉴定为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌。本试验对病死牦牛的内脏组织进行了细菌分离，并通过涂片镜检、生化鉴定、荧光定量PCR法对分离细菌株进行鉴定，再利用17种抗菌药物对该细菌株进行药敏分析，以期为该病的诊断、治疗以及防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR™ Green Master Mix试剂，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；胎牛血清，购自北京索莱宝科技有限公司；细菌培养基、细菌微量生化鉴定管、抗菌素药敏片，均购自杭州微生物试剂有限公司；分析纯均为国产。

1.2 主要仪器

荧光定量PCR仪（QS1，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），体视显微镜（CX21FS1C，奥林巴斯（广州）工业有限公司），生化培养箱（SHP-300，上海鸿都电子科技有限公司），高速冷冻离心机（TGL16，湖南星科科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（HH-2A，北京科伟永兴仪器有限公司），电子天平（0.001 g）（SY204C，上海佑科仪器仪表有限公司），其余试验耗材均为国产。

1.3 样品来源

样品来源于西藏自治区那曲市安多县某养殖户的一头病死牦牛，无菌采集心脏、肝脏、肾脏、脾脏、喉管及淋巴结等组织样品，共计11份。2020年12月24日送至西藏自治区兽医生物药品制造厂兽医实验室。

1.4 试验方法

1.4.1 病料触片镜检 将采集的病料心脏、肝脏、肺脏、淋巴结等组织的病变部位触片，革兰氏染色，镜检。

1.4.2 病原菌分离及培养 将组织病料接种于含有5%血清的肉汤中进行增菌，37℃条件下培养24 h。再将血清肉汤划线接种于营养琼脂平皿、血清琼脂平皿、麦康凯琼脂平皿和三糖铁琼脂斜面，37℃条件下培养24 h，观察菌落形态。随机挑选单菌落接种于血清肉汤，培养24 h，涂片染色镜检。

1.4.3 生化鉴定 按照细菌微量生化鉴定管说明书，将血清肉汤培养物接种至生化反应管，观察显色反应。结果判定参照《兽医微生物学》中多杀性巴氏杆菌生化鉴定标准，详见表1。

表1 多杀性巴氏杆菌生理生化指标

1.4.4 细菌基因组DNA提取 取纯化后血清肉汤培养物1 ml，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行细菌DNA提取。

1.4.5 引物合成 参考Townsend K M等[9]研究文献，设计多杀性巴氏杆菌鉴定引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列及大小见下表2。

表2 Real-time PCR引物信息

1.4.6 荧光定量PCR反应体系及条件 多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR反应体系为20 μl，具体操作如下：SYBR™ Green Master Mix 10 μl，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 7 μl。PCR扩增条件：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，退火温度（表2）15 s，72℃ 1 min，共35个循环，每个循环结束时采集荧光信号；溶解曲线：测量温度为50～95℃。每组样品重复检测3次，分析扩增曲线及扩增溶解曲线。

1.4.7 药敏试验 取已鉴定培养后菌液200 μl滴加至血清琼脂平皿，用无菌涂菌棒涂布菌液，保证涂布均匀。再用镊子取药敏片贴至血清琼脂平皿表面并压平，37℃条件下培养18 h后，测量抑菌圈直径。每种药物3个重复，计算平均值，判定敏感程度。药敏试验抑菌圈直径判定标准见表3。

表3 药敏试验抑菌圈直径判定标准

2 结果

2.1 病料镜检结果

在肺脏、肝脏病料组织中，镜检到短小杆菌。经革兰氏染色，结果为革兰氏阴性杆菌，见图1。

图1 病料组织的革兰氏染色

2.2 病原分离培养结果及菌落形态特征

将病料组织的5%血清肉汤培养液接种于血清琼脂平皿，培养24 h，形成了表面光滑、湿润、边缘较整齐的半透明灰白色菌落，无溶血情况；接种于营养琼脂平皿上菌落贫瘠，且直径小于血清琼脂平皿上的菌落；接种于麦康凯琼脂平皿上未见生长；三糖铁琼脂斜面底部变为黄色。挑取血清琼脂平皿上的菌落，涂片镜检为革兰氏阴性短杆菌，见图2。

图2 细菌液的革兰氏染色

2.3 生化鉴定结果

经细菌微量生化鉴定，该细菌株产酸不产气，可分解葡萄糖、蔗糖和甘露醇，不发酵乳糖、麦芽糖，氧化酶、触酶、鸟氨酸脱羧酶、吲哚试验均为阳性，脲酶试验为阴性，表明该细菌株符合多杀性巴氏杆菌生化鉴定标准。

2.4 荧光定量PCR扩增结果

以细菌组DNA为模板，利用荧光定量PCR检测法对多杀性巴氏杆菌鉴定引物进行扩增。由图3、图4可知，Kmt1基因的扩增曲线有明显的S型指数增长曲线，且溶解曲线为单峰；由图5、图6可知，16S rRNA的扩增曲线有明显的S型指数增长曲线，且扩增溶解曲线为单峰。表明该细菌株DNA基因组中能扩增出多杀性巴氏杆菌鉴定基因。

图3 Kmt1基因的扩增曲线

图4 Kmt1基因的溶解曲线

图5 16S rRNA的扩增曲线

图6 16S rRNA的溶解曲线

2.5 药敏试验结果

药敏试验检测了该细菌株对链霉素、头孢类等17种抗菌药物的敏感程度。由表4可知，该细菌株对头孢曲松、头孢他啶、氧氟沙星、麦迪霉素等13种抗菌药物表现为敏感，对氨曲南、头孢噻肟、哌拉西林、链霉素等4种抗菌药物表现为中介，无抗菌药物表现为耐药。

表4 药敏试验结果

3 讨论

受西藏地区空气稀薄、气压低、含氧量少等因素影响，大多数牦牛的呼吸系统易遭受损伤。多杀性巴氏杆菌主要侵袭呼吸系统、局灶性感染以出血性败血症为主要特征，是影响西藏牦牛健康的主要细菌之一。

首先，本研究无菌采取病死牦牛组织样品11份，触片镜检发现大量革兰氏阴性短杆菌，再利用5%血清肉汤培养液复壮，接种于血清琼脂平皿、营养琼脂平皿、麦康凯琼脂平皿等平皿，结果显示该细菌株在血清琼脂平皿可形成表面光滑、湿润、边缘较整齐的半透明灰白色菌落，无溶血情况；在营养琼脂平皿上菌落贫瘠，且直径小于血清琼脂平皿的菌落；在麦康凯琼脂平皿上未见生长；三糖铁琼脂斜面底部变为黄色，菌液镜检为革兰氏阴性短杆菌，因此初步怀疑为巴氏杆菌。

其次，利用微量生化鉴定管对该细菌株进行了生化鉴定，结果显示该细菌株符合多杀性巴氏杆菌生化鉴定标准。

再次，以细菌组DNA为模板，用荧光定量PCR检测法对多杀性巴氏杆菌鉴定引物进行扩增，结果显示该细菌株DNA基因组中能扩增出多杀性巴氏杆菌鉴定基因，进一步表明该细菌株为多杀性巴氏杆菌株。

最后，利用17种抗菌药物对该细菌株进行了药敏分析，结果显示链霉素、头孢类等17种抗菌药物中13种抗菌药物对该细菌株有抑制作用。

4 结论

本试验对病死牦牛内脏组织进行了细菌分离，再通过涂片镜检、生化鉴定、荧光定量PCR法对分离细菌株进行了鉴定，结果表明分离细菌株为多杀性巴氏杆菌株。通过药敏试验发现，头孢曲松、头孢他啶、氧氟沙星、麦迪霉素等13种抗菌药物对该细菌株有显著抑制作用，但其抑菌机理还需进一步研究。对氨曲南、头孢噻肟、哌拉西林、链霉素等4种抗菌药物表现为中介，无抗菌药物表现为耐药。