质谱快速鉴定联合直接药敏试验在肠杆菌目细菌血流感染诊断中的应用评估

陆燕飞，刘根焰，张晓慧，许雨乔，倪芳，文怡(南京医科大学第一附属医院检验学部，南京210029)

血培养是诊断血流感染的金标准。在血培养瓶阳性报警后通常需要48～72 h才能获得传统的血培养细菌鉴定与药敏试验结果。快速的血培养细菌鉴定、及时可靠的药敏结果对临床及早合理使用抗菌药物、降低患者死亡率有重要意义。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术可直接对血培养阳性标本进行快速鉴定且具有较高的准确性[1]。欧洲药敏试验委员会(EUCAST)和美国临床和实验室标准化协会(CLSI)在2018年和2021年分别发布了纸片法血培养阳性瓶直接快速药敏试验(rapid antimicrobial susceptibility testing, RAST)方法[2-3]，致力于缩短血培养药敏报告时间。采用EUCAST方法可在4～8 h内获得快速药敏结果，而CLSI方法则需要16～18 h。本研究在MALDI-TOF MS快速鉴定的基础上参考EUCAST血培养RAST方法对肠杆菌目细菌的血培养阳性标本进行RAST，并将结果与常规药敏结果进行对比，以期为本实验室建立血培养快速鉴定及药敏试验方法提供依据。

1 材料和方法

1.1菌株来源 收集2020年4月—7月南京医科大学第一附属医院血培养报阳后直接涂片为单一革兰阴性杆菌标本，排除3 d内重复送检为同一种细菌及混合感染的标本。

1.2仪器与试剂 BACTEC TM FX血培养系统和血培养瓶(美国BD公司)；Vitek MS质谱仪、Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定和药敏系统及配套试剂(法国生物梅里埃公司)；血平板、巧克力平板、M-H琼脂平板(郑州安图生物公司)；药敏纸片(英国Oxoid公司)；真空采血管(Greiner bio-one公司)。

1.3方法

1.3.1血培养阳性标本快速鉴定及药敏试验

1.3.1.1Vitek MS快速鉴定 血培养阳性报警后，取出阳性瓶内培养物进行革兰染色，当镜下显示单一革兰阴性杆菌时，颠倒混匀血培养瓶，用无菌注射器抽取4 mL阳性血培养液至带分离胶的真空采血管内，室温3 500 r/min离心10 min，弃上清液后加入1 mL无菌去离子水，混匀并转移至1.5 mL EP管内，16 000×g离心1 min，弃上清液后加入75%乙醇混匀，16 000×g离心2 min，弃上清液，待乙醇挥发后加入20 μL无菌去离子水混匀沉淀，取0.5 μL沉淀点样至金属靶板，加1 μL基质液，待靶板干燥后使用Vitek MS进行快速鉴定。

1.3.1.2阳性血培养液RAST 以MALDI-TOF MS快速鉴定结果为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的血培养阳性标本作为RAST的研究对象。参考2018年EUCAST公布的阳性血培养液RAST方法[2]，即从血培养瓶中直接吸取100 μL阳性培养液至直径90 mm的M-H平板上，均匀涂布后贴上相应抗菌药物纸片，药敏纸片包括哌拉西林/他唑巴坦(TZP，36 μg/6 μg)、头孢噻肟(CTX，5 μg)、头孢他啶(CAZ，10 μg)、美罗培南(MEM，10 μg)、环丙沙星(CIP，5 μg)、阿米卡星(AK，30 μg)、庆大霉素(CN，10 μg)，35 ℃温育4 h、6 h、8 h后，分别从正面量取抑菌圈直径，根据EUCAST指南中不同细菌在不同时间的快速药敏折点判读药敏结果，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。参考EUCAST标准，RAST药敏结果可分为敏感、耐药和技术不定区域(area of technical uncertainty, ATU)。ATU是细菌敏感与耐药折点重叠的区域，抑菌圈直径范围通常在1～3 mm[2]，与CLSI中“中介”的概念不同。当抑菌圈直径落入此范围时，其判断为敏感、中介、耐药的错误率比较高，因此对于ATU结果不提供药敏结果的判读[2,4]。

1.3.2血培养阳性标本常规鉴定及药敏试验 当血培养仪提示阳性报警时，取出阳性瓶进行革兰染色并转种至相应平板温育18～24 h，分离出单个菌落，制备成0.5个麦氏浊度单位菌悬液。革兰阴性杆菌采用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定分析仪配套鉴定卡及药敏卡(AST GN09)进行菌株鉴定及药敏，同时加做CTX(30 μg)K-B法药敏试验。药敏结果按照CLSI M100-S29规定进行判读，当仪器显示亚胺培南或美罗培南耐药时经K-B法复核后，根据CLSI定义判定为耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae bacteria，CRE)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.3.3药敏结果比较 比较RAST药敏与常规药敏结果的一致性，判断标准如下：(1)符合(categorial agreement, CA)：常规药敏结果为敏感(或耐药)，RAST结果为敏感(或耐药)；(2)错误(error, Er)：常规药敏结果与RAST结果不一致，包括①非常重大错误(very major errors, VME)：假敏感，即常规药敏结果为耐药，RAST结果为敏感；②重大错误(major errors, ME)：假耐药，即常规药敏结果为敏感，RAST结果为耐药；③微小错误(minor errors, mE)：常规药敏结果为中介，RAST结果为敏感或耐药。无ATU结果的判读及比较。

1.4统计学分析 用SPSS 22.0软件进行。计数资料以例数(百分比)表示。四格表资料采用χ2检验进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Vitek MS快速鉴定与常规鉴定结果比较分析 共有126例血培养阳性标本利用Vitek MS进行快速鉴定，Vitek 2 Compact常规鉴定为肠杆菌目细菌104株和非发酵革兰阴性杆菌22株。质谱快速鉴定肠杆菌目细菌的检出率为96.2%(100/104)。细菌快速鉴定结果与常规鉴定结果一致，见表1。Vitek MS快速鉴定通常可在1 h内完成。

表1 革兰阴性杆菌血培养阳性标本Vitek MS快速鉴定与常规鉴定结果比较

2.2阳性血培养液RAST药敏结果分析

2.2.1RAST可量取的抑菌圈直径结果分析 共有90株肠杆菌目细菌进行血培养RAST，包括肺炎克雷伯菌50株和大肠埃希菌40株。肠杆菌目细菌阳性血培养液RAST在4 h、6 h、8 h可量取抑菌圈的比例分别为94.3%、100%、100%。见表2。

表2 细菌各时间段可量取抑菌圈直径的比例(%)

2.2.2RAST药敏结果判读 在4 h、6 h、8 h判读肠杆菌目细菌药敏结果时，7种抗菌药物在4 h、6 h、8 h时的RAST结果平均CA比例上升，分别为76.0%(453/596)、92.4%(551/596)、94.0%(560/596)；ATU比例下降，分别为17.8%(106/596)、7.0%(42/596)、5.7(34/596)。6 h判读肠杆菌目细菌药敏结果的符合率优于4 h判读肠杆菌目细菌药敏结果的符合率(χ2=15.566，P<0.001)，与8 h差异无统计学意义(χ2=0.495，P=0.482)。4 h、6 h、8 h药敏结果判读时CA比例最高的抗菌药物分别为CIP、MEM、MEM；CA比例最低的抗菌药物分别为TZP、CAZ、CAZ。4 h、6 h、8 h药敏结果判读平均错误的比例分别为0.7%(4/596)、0.5%(3/596)、0.5%(3/596)，仅有1例肺炎克雷伯菌对CTX的药敏结果在3个时间点判读时均为VME，见表3。肺炎克雷伯菌在各时间段判读的药敏结果CA比例均高于大肠埃希菌；ATU比例均低于大肠埃希菌，其中两者CA及ATU比例在4 h和6 h判读时的差异有统计学意义，见表4。

表4 肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌各判读时间药敏结果比较[n(%)]

2.2.3血流感染CRE时RAST药敏结果分析及比较 共有25株CRE，在4 h、6 h、8 h 药敏判读时CRE检出率分别为92.0%(23/25)、96.0%(24/25)、96.0%(24/25)，各时间段CRE检出率差异无统计学意义(χ2=0.528，P=0.768)。CRE菌株分别在4 h、6 h、8 h判断整体抗菌谱时，平均CA分别为96.0%(167/174)、97.7%(170/174)、98.3%(171/174)，差异无统计学意义(χ2=1.908，P=0.385)；平均ATU分别为3.4%(6/174)、1.7%(3/174)、1.1%(2/174)，差异无统计学意义(χ2=2.415，P=0.299)。见表5。

表5 CRE各时间段快速药敏结果符合率比较(%)

3 讨论

一项荟萃分析显示，利用MALDI-TOF MS对阳性血培养液进行快速鉴定时，对革兰阴性菌特别是肠杆菌目细菌具有极高的准确性，对革兰阳性菌鉴定的准确率略低[5]。由于细菌分布及阳性血培养液前处理方法不同，各研究的准确率有所差异[6]。本研究126株革兰阴性菌中121株可快速准确鉴定到种，准确率高达96.0%，且鉴定时间控制在1 h内，为临床早期经验性用药及后续快速药敏结果判读提供了快速可靠的病原学依据。

阳性血培养液RAST近年来已成为国内外研究的热点[7]。目前，快速获得血培养病原菌药敏结果的方法众多，部分研究者将阳性血培养液预处理后制备成0.5麦氏浊度单位的菌悬液，使用自动化仪器或纸片扩散法进行药敏试验[8]，此法耗时相对较长，特别是纸片扩散法仍需18～24 h，且无规范化折点来判断药敏结果；有学者用直接涂片检查分析不同抗菌药物条件下细菌形态的变化，可在6 h内检测细菌的耐药性[9]，该方法较为复杂，不易常规操作；谷钰峰等[10]利用流式细胞术对微生物的代谢参数进行检测，可在3 h内检测细菌对抗菌药物的敏感性，此法仪器价格昂贵，一般实验室难以检测；另外，利用分子生物学手段可以快速检测细菌的耐药基因[11]，但检测价格昂贵，不易常规检测。2018年4月EUCAST发布了阳性血培养液RAST及折点，该法方法简单、成本低、耗时短，易于实验室常规开展及标准化，具有普遍适用性，在一定程度上可弥补上述各方法存在的缺陷，目前肠杆菌目细菌中肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌可进行RAST。

本研究在质谱快速鉴定的基础上参考EUCAST阳性血培养液RAST方法，分别在4 h、6 h、8 h对90例阳性血培养液RAST结果进行分析。研究发现肠杆菌目细菌大部分抑菌圈直径4 h即可量取，且肺炎克雷伯菌可量取比例高于大肠埃希菌，6 h起大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径即可全部测量，与现有研究结果一致[12]。细菌抑菌圈直径量取的准确性直接影响后续药敏结果的判读，若出现细菌生长不良或抑菌圈边缘不清时不应量取，对于大肠埃希菌温育早期可能存在抑菌圈内的薄雾状生长应忽略[1,12]。各时间点量取的抑菌圈直径根据EUCAST血培养液RAST药敏折点进行判读[1]，每种细菌在4 h、6 h、8 h都有独立的折点，可分别进行药敏分析。有文献报道若将RAST抑菌圈直径使用常规的药敏折点进行判读，结果准确性偏低[13]。

根据CLSI M52及美国FDA规定，一个可接受的药敏系统必须要达到的条件包括CA≥90%、VME≤1.5%、ME≤3.0% 以及mE<10%[13-14]。本研究结果显示，肠杆菌目细菌从6 h判读时CA比例即>90%，与4 h相比差异有统计学意义，但与8 h相比无明显差异，提示6 h判读肠杆菌目细菌整体抗菌谱在准确性和时间上具有优势，Soo等[14]的研究也得出类似结论。不同抗菌药物在不同时间点判读时药敏结果符合率有所差别，有文献报道4 h判读肠杆菌目细菌药敏结果时，TZP和CIP分别表现出最低和最高的CA(60% vs 94.6%)，而当6 h判读时CA最低和最高的抗菌药物则为AK和MEM(88.5% vs 98.4%)[13]。本研究4 h药敏判读结果与上述文献报道一致，其中TZP仅有55.6%的RAST药敏结果与常规相符，可能是由于此药ATU范围内的抑菌圈直径跨度较大，导致很大一部分药敏结果落在ATU范围内，从而降低了CA的比例。MEM从6 h起即成为药敏符合率最高的抗菌药物，CA比例高达98.9%，仅有1株耐药株的药敏结果落在ATU范围内，可能是由于抑菌圈直径量取误差导致。肺炎克雷伯菌CA的比例普遍高于大肠埃希菌，表明此RAST针对肺炎克雷伯菌血流感染存在优势。

本研究中25株CRE在4 h、6 h、8 h的检出率无明显差异，表明CRE可提前至4 h判断。由于CRE菌株对大多数抗菌药物均耐药，因此临床更关注CRE快速药敏结果为敏感的抗菌药物的结果准确性， 此RAST方法中AK、CN、CIP及CAZ无判断错误的情况发生，仅有1株CTX耐药的肺炎克雷伯菌在3次药敏判读时均判读为敏感，可能是由于抑菌圈直径量取时，刚好落在敏感折点处发生错误，各时间段CRE药敏CA的比例差异无统计学意义，4 h即可判断整体抗菌谱。

研究结果显示，肠杆菌目细菌在4 h、6 h、8 h判读时药敏结果的错误比例均远小于CLSI M52及FDA标准，Jasuja等[15]报道TZP和CIP存在VME的情况，本研究暂未发现，可能与菌株数量有关，该现象有待进一步研究探讨。 ATU是阳性血培养液RAST不可忽视的一部分。一般来说，温育时间越短，ATU结果的比例越高[1,13]，本研究结果显示肠杆菌目细菌在4 h时的ATU比例最高，6 h、8 h可从17.2%降至6.9%、5.4%。ATU区域的存在减少了假敏感和假耐药的情况发生，降低了VME和ME的比例[15]，但同时也会降低CA的比例，过高的ATU比例可导致过多的药敏结果留白，降低快速药敏的准确性[15]，本研究中ATU比例最高的抗菌药物其CA比例亦最低。

当然，本研究目前仍存在一定缺陷，耐药菌分析的数量不多，且未对非发酵菌及革兰阳性菌快速药敏进行评价。有关阳性血培养液RAST方法学，目前也仍有一些问题需要探讨，如其他血培养常见肠杆菌目细菌是否可以进行RAST、折点如何确立；如何克服抑菌圈量取时的人工误差；怎样将此RAST方法流程合理化，这些问题都有待进一步研究解决。

综上所述，肠杆菌目细菌血培养阳性标本质谱快速鉴定准确性高，参考EUCAST血培养RAST方法，肠杆菌目细菌血培养标本快速药敏结果与常规结果一致性好，6 h可作为肠杆菌目细菌RAST药敏判读的最佳时间点，4 h即可判断是否存在CRE感染并推测其整体抗菌谱。