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1例血型嵌合体的血清学特点及测序分析*

2022-01-05洪健娇邓刚贺云蕾宁波市中心血站献血服务一科浙江宁波315010

临床检验杂志 2021年11期
关键词:嵌合体等位基因B型

洪健娇,邓刚,贺云蕾(宁波市中心血站献血服务一科,浙江宁波 315010)

嵌合体指其细胞衍生自2个或多个受精卵的个体,遗传学上指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体,免疫学上则指一个机体有2种或2种以上染色体组成不同的细胞系彼此耐受不排斥的嵌合状态。血型嵌合体是嵌合体的一种,又叫血型开米拉,即Twin Chimeras[1];多发生在异型输血、异卵双生或双精受精以及异型骨髓移植后,其中异型输血或异型骨髓移植后的血型嵌合属于暂时性嵌合,而遗传性嵌合属于永久性嵌合(先天性嵌合)。血型嵌合体的存在往往带来血型鉴定困难、输血困难、亲缘关系疑问等问题。在日常的输血血型鉴定工作中,时常遇到混合凝集现象,即部分细胞形成小凝块,部分细胞不凝集的状态。形成混合红细胞凝集原因分为内源性和外源性因素,外源性因素通常包括血型不合输血等,内源性因素包括嵌合体、ABO亚型和造血干细胞移植后血型转变期等。这些混合凝集给血型鉴定造成困难,给临床安全有效输血造成一定影响。我们在工作中发现1例ABO血型嵌合体,现报道如下。

1 材料与方法

1.1研究对象 患者,女,73岁,因肾肿物需要进行手术,术前血型鉴定发现正定型均呈混合凝集外观。通过查阅患者病历及经医生确认,该患者无输血史,无移植史。查询该患者其他血液指标均无异常,排除血液病、感染等因素。

1.2主要仪器与试剂 Labofuge 200小型台式离心机(美国赛默飞公司),KA-2200洗涤离心机(日本久保田公司),凝胶卡离心机(美国伯乐公司),Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR仪(美国Applied Biosystems公司);血型血清学试剂(上海血液生物医药有限公司),全血DNA提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)。

1.3标本采集与处理 用微柱凝胶法,对EDTA-K2抗凝血标本进行ABO血型鉴定以及不规则抗体筛查。

1.4试管法血清学血型鉴定 正定型:用洗涤过3遍的红细胞制作2%~4%的红细胞悬液,分别与抗A、抗B试剂反应。反定型:取患者血清2滴与标准A1型红细胞、B型红细胞、O型红细胞反应,加做抗人球蛋白试验以及抗AB、抗H、抗A1试验。用人源抗A血清通过凝集有A抗原的红细胞和不凝集无A抗原的红细胞,分离2群红细胞。将不与抗A反应的红细胞重新检测血型;同时用DTT处理与抗A发生凝集的红细胞后,也重新检测血型。同样用人源抗B血清通过凝集有B抗原的红细胞和不凝集无B抗原的红细胞,分离2群红细胞。将不与抗B反应的红细胞重新检测血型;同时用DTT处理与抗B发生凝集的红细胞后,也重新检测血型。上述所用商品试剂均购自上海血液生物医药公司,人源多克隆抗A及抗B血清均为自制试剂,效价大于128。

1.5ABO基因测序 用全血基因组DNA提取试剂盒抽提全血基因组DNA,按照参考文献[2-3]中的引物及扩增体系,对ABO基因7个外显子及其邻近内含子区域分别扩增后送测序公司(深圳华大基因科技公司)测序。扩增反应总体积25 μL,包括10×PCR缓冲液2.5 μL,基因组DNA标本50~100 ng,Taq DNA聚合酶1 U(大连TaKaRa公司),dNTP和MgCl2终浓度分别为0.2 mmol/L和1.5 mmol/L,引物终浓度为0.5 μmol/L。

2 结果

2.1微柱凝胶法正、反定型 正定型呈混合凝集,抗A及抗B均上下分层;反定型为AB型,不规则抗体阴性(见图1)。

注:A,正、反定型结果;B,不规则抗体筛检结果。图1 微柱凝胶法血清学检测结果

2.2试管法血清学血型鉴定 正定型与抗A凝集4+mf(mf:混合凝集),与抗B凝集4+mf,抗A管及抗B管有明显游离红细胞。反定型为AB型,结果与微柱凝胶法一致。加做试验结果如下:直抗阴性,与抗AB凝集4+,抗A1凝集4+mf,抗H凝集1+。用人源抗A通过凝集有A抗原的红细胞和不凝集无A抗原的红细胞,分离2群红细胞并鉴定其血型。发现不与抗A反应的那群红细胞血型为B型;与抗A发生凝集的那群红细胞血型为A型,即该双群细胞,分别为A型和B型。用人源抗B通过凝集有B抗原的红细胞和不凝集无B抗原的红细胞,分离两群红细胞并鉴定其血型。发现不与抗B反应的那群红细胞血型为A型;与抗B发生凝集的那群红细胞血型为B型,即该双群细胞,分别为A型和B型,与人源抗A实验结果一致。

2.3测序结果 测序结果显示,ABO基因存在c.261delG、c.297A>G、c.467C>T、c.526C>G、c.646T>A、c.657C>T、c.681G>A、c.703G>A、c.771C>T、c.796C>A、c.803G>C、c.829G>A、c.930G>A杂合突变(见图2)。通过与国际输血协会(ISBT)命名的ABO等位基因进行比对,发现患者存在3条ABO等位基因,分别为ABO*O.01.02、ABO*A1.02和ABO*B.01(见表1)。

注:A,ABO*B.01等位基因突变位点;B,ABO*O.01.02等位基因突变位点;C,ABO*A1.02等位基因突变位点。图2 ABO基因测序结果

表1 测序结果显示存在3条ABO等位基因

3 讨论

血型嵌合体通常在检测中出现混合凝集外观,即同时存在2种红细胞群。目前国内外均有先天性嵌合体血型的报道[4-6],但因其发生十分罕见,因此相关报道较少。血型嵌合体不仅表现在ABO血型,其他血型如P系统、Kidd系统以及Duffy系统中均可存在[7]。嵌合体现象常常会导致ABO血型遗传不符合经典遗传规律,因为其体内存在遗传上不同类型细胞的混合。

先天性嵌合体(又称永久性嵌合体)的形成机制目前认为主要分为两类。一类是由于妊娠早期异卵双生子之间存在血管的交叉吻合,造血干细胞经由吻合的血管通路进入对方体内,同时在获得性免疫耐受的基础上,植入的造血干细胞可在对方体内长期增殖,导致由造血干细胞发育成熟的体内全部细胞都是嵌合的[8]。另一类是在受精过程中,由2个卵细胞和2个精子相互结合而产生的四倍体,这一四倍体受精卵继续进行减数分裂,产生多种不同来源的细胞系[9-10]。由于本研究中的先证者被分娩时并非双胎,无输血史和干细胞移植史,因此推测更可能为第二类嵌合体。

嵌合体血型应引起重视,一方面嵌合体血型误诊能引起严重的输血反应[11],另一方面血型嵌合体免疫耐受的研究对基因干细胞移植和骨髓移植有着深远的影响。临床上一些血液疾病、药物使用、移植或者非同型血液的输注也会导致混合凝集这一现象,因此在出现疑难血型时,首先需要向患者问清病史、输血史、移植史、药物使用情况等,在此基础上可以进行相关的实验操作。本文中该A+B型嵌合体患者血样与AB型献血者血样交叉配血时,在盐水法、聚凝胺法、凝胶卡法中均无凝集无溶血,因此可输注AB型红细胞制品。

目前输血科的血型鉴定趋于自动化,但对仪器所报告的结果仍需要仔细查看,有疑问的血型需要结合试管法及相关试验来验证。

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