细胞焦亡的发生机制及其在肝脏疾病发生发展中的作用

2022-01-05王欣悦李德冠

临床肝胆病杂志 2021年12期

王欣悦，李德冠

中国医学科学院&北京协和医学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津 300192

细胞焦亡是一种非典型的程序性细胞死亡方式，其发生依赖半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspases)的激活，并伴随着细胞膜穿孔和细胞内容物释放引发的炎症反应。细胞焦亡如果发生在肝癌细胞等损伤细胞中，可以加速免疫应答，清除损伤细胞以拮抗病原体的感染；但是如果发生在肝星状细胞等正常细胞中，就容易扩大炎症反应，导致正常细胞大量死亡、组织增生和器官功能衰竭，可见细胞焦亡在肝脏疾病的发生发展中具有“双刃剑”的特征。现围绕着细胞焦亡的发生机制及其在肝脏疾病中的研究进展进行综述，以期为此类疾病的防治和新药开发提供新的思路。

1 细胞焦亡的发现

“细胞焦亡”这一现象于1992年由Zychlinsky等[1]在弗氏志贺杆菌感染的巨噬细胞中首次发现。2001年，Cookson首次使用“细胞焦亡(pyroptosis)”来形容这种细胞死亡方式[2]。2009年，细胞死亡命名委员会根据细胞死亡的形态学改变命名了13种类型，“细胞焦亡”是第13种死亡方式[3]。在形态学上，细胞焦亡伴随着细胞核固缩、DNA断裂、细胞膜气泡样凸起，膜上迅速形成12～14 nm的小孔，水分内流，细胞发生肿胀而膜破裂[4]。在生化上，细胞焦亡伴随着caspases的激活，Gasdermin蛋白的切割和IL-1β、IL-18等炎性因子的释放，其发生过程为一种新型程序性细胞死亡方式[5]。

2 细胞焦亡的分子机制

人和鼠细胞焦亡的发生均存在三种途径[6](图1)。

2.1 依赖caspase-1的细胞焦亡途径病原体表面或核内的特殊微生物结构为病原体相关分子模式，受损宿主细胞释放的内容物信号为损伤相关分子模式，二者均可作为刺激原信号被固有免疫细胞上的模式识别受体识别，发生寡聚化，组装成炎性小体[7]。炎性小体募集caspase-1前体，使caspase-1前体蛋白发生自剪接激活。激活的caspase-1蛋白裂解GSDMD蛋白释放出31 kD的GSDMD-N片段，这一片段能特异性的识别并结合细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸和磷脂酰肌醇，从而在细胞膜上形成大的非选择性膜孔道，使细胞膜失去控制物质进出的能力，细胞释放出IL-1β、IL-18等炎性小体，同时肿胀破裂，发生细胞焦亡[8]。

2.2 依赖caspase-11 (caspase-4、5)的细胞焦亡途径在由细菌脂多糖(LPS)启动的细胞焦亡中，caspase-11发生寡聚化后被激活[9]。活化的caspase-11切割GSDMD前体释放出GSDMD-N端P30片段[10]，GSDMD-N片段与细胞膜上的心磷脂结合[11]，从而在细胞膜上穿孔，激活控制小分子进出的受体Pannexin-1，打开膜通道P2X7，导致K+和ATP外流，从而促进细胞焦亡的发生[12]。在这一焦亡途径中，虽然caspase-11可以不依赖于caspase-1而直接介导细胞焦亡的发生，但是IL-1β前体只能由caspase-1裂解，GSDMD蛋白可被已经活化的caspase-1/11/4、5蛋白切割。

注：Death Receptor，死亡受体；Chemotherapy drugs，化疗药物；Virus，病毒；Toxins，毒素；Bacteria，细菌；Cytochrome c，线粒体细胞色素c；Apoptosis，细胞凋亡。

2.3 依赖caspase-3的细胞焦亡途径在化疗药物作用下，肿瘤细胞中激活的caspase-3可特异性地切割GSDME蛋白，生成具有活性的GSDME-N片段，随后驱动细胞从凋亡转换成焦亡[13-14]；进而可以激活抗肿瘤免疫力抑制肿瘤生长[15]。

3 细胞焦亡与肝脏相关疾病

据国际癌症研究机构公开数据，中国已经有超过五分之一的人口受到肝脏疾病的影响，约有700万人患有肝硬化，每年新发肝癌病例为46万例，中国已成为全球肝脏疾病患者数量最多的国家[16]。常见的肝脏疾病包括病原体感染等引起的病毒性肝炎、酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物性肝损伤(DILI)，以及肝细胞癌(HCC)等[17]。细胞焦亡在肝脏疾病中发挥重要作用，现对其研究进展总结如下。

3.1 细胞焦亡与病毒性肝炎病毒性肝炎是世界上最常见的慢性病毒感染性疾病，其中HBV和HCV是最常见的感染[18-19]。研究证实细胞焦亡在病毒性肝炎发生中发挥着重要作用。

利用 HBV感染HL7702肝细胞系时发现HBV中的X蛋白可以激活依赖caspase-1的细胞焦亡通路[20]。与未经治疗的HBV感染者肝脏相比，接受持续抗病毒治疗HBV感染者的肝脏中caspase-1、NLRP3和IL-1β的表达显著下调，肝细胞内mitoROS含量增加，细胞外基质沉积的杂质增加[21]，提示HBV感染导致正常肝细胞发生了PAMP/NLRP3/caspase-1/IL-1β途径的细胞焦亡，阻断正常肝细胞的细胞焦亡可以起到抗HBV的效果。HBV除了引起普通肝细胞发生细胞焦亡，还可以引起肝血窦中的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)等免疫细胞发生细胞焦亡，释放的IL-18、IL-1β等促炎介质募集巨噬细胞清除病原体和损伤细胞，阻断疾病进程。Chen等[22]研究发现，HBV感染者中PBMC发生依赖AIM2/ caspase-1/GSDMD/IL-18通路的细胞焦亡，进而促进HBV的免疫清除；但是HBV表面的HBeAg蛋白会通过NF-κB通路抑制PBMC发生细胞焦亡。

Kofahi等[23]用HCV感染Huh-7.5肝细胞后，在细胞中检测到活化的caspase-1和NLRP3，在细胞外检测到乳酸脱氢酶。HCV相关晚期肝硬化患者中的caspase-1和NLRP3的表达水平也较健康的肝脏样本高[24]。提示HCV被识别后可以诱导炎性小体NLRP3的组装，引发肝细胞发生细胞焦亡，导致肝损伤。Alhetheel等[25]研究发现，HCV通过下调STAT1和IRF-1的表达，抑制PBMC中细胞焦亡通路，阻止PBMC对HCV发生反应，导致HCV免疫逃逸，使肝细胞易受感染。上调PBMC中的细胞焦亡，可以加强免疫清除，阻止HCV的侵袭。

3.2 细胞焦亡与ALD ALD是一种由长期酗酒导致的慢性肝病，其特征是初期表现为脂肪肝，后期肝衰竭，发生酒精性肝炎并伴随败血症和多器官功能衰竭等并发症，其短期病死率很高[26]。肝细胞焦亡是导致ALD的重要原因，依赖caspase-1和依赖caspase-11的细胞焦亡途径均参与了ALD的发生发展[27]。Heo等[28]研究发现，乙醇代谢产生的FoxO1蛋白导致TXNIP蛋白过表达；而TXNIP可激活NLRP3 炎性小体和caspase-1细胞焦亡通路，导致ALD的发生。Khanova等[29]研究发现，经8周乙醇饮食喂养的小鼠肝匀浆中caspase-11和GSDMD的活性明显增加。乙醇代谢增加了NADH/NAD+的比例，产生的活性氧(ROS)引起NLRP3的组装，诱导肝细胞发生依赖caspase-11的细胞焦亡，引起全身性炎症反应综合征和败血症，危及生命。此外，caspase-11基因敲除可抑制乙醇喂养造成的小鼠肝细胞焦亡的发生，减轻肝脏炎症和脂肪变性[30]；NLRP3缺陷也可以改善肝脂肪变性和慢性乙醇造成的损伤[31]。这些结果说明，抑制caspase介导的细胞焦亡，可以缓解ALD的症状[32]。

3.3 细胞焦亡与NASH NASH是指与酒精滥用无关的肝脏疾病。高脂饮食、缺乏锻炼等都可能会引起非酒精性脂肪肝，其特征为肝细胞内脂肪变性和过度堆积，非酒精性脂肪肝患者会逐渐发展为NASH[33]。在NASH的发生发展中，细胞焦亡发挥着重要的作用。

高脂饮食会引发肝细胞发生细胞焦亡，Ioannou等[34]用胆固醇含量≥0.5%的饮食喂养小鼠时，在肝巨噬细胞Kupffer细胞中检测到了细胞焦亡。Koh等[35]发现，NLRP3基因敲除的小鼠由于缺乏诱导细胞焦亡通路的炎性小体，因而避免了高胆固醇饮食导致的NASH。Xu等[36]检测到NASH小鼠肝组织中GSDMD-N末端片段的表达上调，而GSDMD敲除的小鼠表现出较低的脂肪变性和炎症反应。提示胆固醇晶体可激活炎性小体NLRP3，切割生成GSDMD-N诱发细胞焦亡，诱发炎症。

3.4 细胞焦亡与DILI DILI发病机制复杂，涉及遗传、代谢和免疫等多种因素；表现为短时间内发生大量的肝细胞坏死和肝功能的迅速丧失，是引起急性肝衰竭的重要原因[37]。细胞焦亡也参与了DILI的发生。

对乙酰氨基酚引起的DILI是研究最多的药物之一。Jaeschke等[38]研究发现，对乙酰氨基酚的代谢产物可以作为DAMP引起炎性小体NLRP3组装，从而导致依赖caspase-1的细胞焦亡发生，导致DILI。Imaeda等[39]发现利用阿司匹林等限制DILI中caspase-1的组装可以抑制细胞焦亡发生，进而降低肝细胞的病死率，减轻了肝损伤。

DILI中发生细胞焦亡会加重肝损伤。Xu等[40]研究发现，caspase-3特异性抑制剂Ac-DMPD/DMLD-CMK可以降低DILI中肝细胞的细胞焦亡发生，从而减少肝细胞损伤，缓解DILI。但是由于DILI的发病机制是多因素的，宿主因素如年龄、性别、伴发疾病和药物、表观遗传学、感染、饮食等其他因素都使其变得更加复杂，再加上缺乏有效的动物模型，人们对DILI的机制了解甚少，目前细胞焦亡在DILI中的作用机制仍有待进一步明确[41]。

3.5 细胞焦亡与HCC 细胞焦亡对于细胞本身而言，不利于自身的存活和增殖，但是如果发生在癌细胞中则有利于癌细胞的清除。因此，激活癌细胞中细胞焦亡或许能为癌细胞的治疗提供新思路。

在HCC中，肝癌细胞通过抑制自身的caspase-1途径防止细胞焦亡发生，起到自我保护的作用。Chen等[42]研究发现，HepG2肝癌细胞系中小核仁RNA宿主基因7(small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7)通过靶向microRNA-34a/SIRT1轴抑制细胞焦亡发生，促进细胞增殖、迁移和侵袭；而敲低SNHG7基因可解除HCC中细胞抑制自身发生caspase-1依赖的细胞焦亡，从而加剧肝癌细胞的死亡，抑制体内HCC肿瘤的生长。Guo等[43]研究表明，天然异喹啉生物碱小檗碱通过激活caspase-1活化诱导小鼠HCC发生细胞焦亡，从而增强HCC小鼠中癌细胞的免疫清除作用。Wei等[44]研究发现，雌激素17β-雌二醇通过上调NLRP3的表达诱导HCC发生依赖caspase-1途径的细胞焦亡，阻碍HCC的发展和转移。

HCC细胞还可通过抑制caspase-11和caspase-3的途径发挥自我保护作用。Lozano-Ruiz等[45]研究发现，在HCC发生的早期阶段，细胞会通过mTOR-S6K1途径下调AIM2和caspase-11的表达抑制自身发生细胞焦亡，增加细胞增殖和集落形成。Wang等[46]发现，HCC细胞中caspase-3的活性受到PI3K/AKT/mTOR信号途径抑制，进而抑制细胞焦亡，刺激HCC细胞的生长，上调HCC焦亡通路中相关蛋白的表达，可使肿瘤细胞发生细胞焦亡，减少肿瘤细胞数量。Wang等[47]发现，上调HepG2细胞中的GSDME基因表达会诱导细胞周期阻滞在G2/M中，从而抑制其细胞增殖。Liang等[48]研究发现，姜黄素可以通过细胞内ROS积累，诱导caspase-3和GSDME的表达，导致HepG2细胞发生细胞焦亡。

HCC细胞死亡方式中除细胞焦亡外，还存在细胞凋亡等其他死亡方式的叠加和转化[49]。Zhang等[50]发现从丹参根中分离出的菲醌衍生物Miltirone能激活线粒体固有凋亡通路并通过中心信号轴ROS/ERK1/2-BAX-caspase 9-caspase 3-GSDME诱导HCC细胞从细胞凋亡转换成细胞焦亡。