肝外胆管癌患者肠道菌群变化分析

李 涛， 王盼梁， 袁梓博， 冯泉凯， 李 捷

1 郑州大学第一附属医院 肝胆胰外科， 郑州 450052； 2 河南省消化器官移植重点实验室， 郑州 450052；3 郑州市器官移植技术与应用工程重点实验室， 郑州 450052

胆管癌是一种源于胆道上皮的恶性肿瘤，根据解剖位置不同，胆管癌分为肝内胆管癌和肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,ECC)。近几十年，全球ECC的发病率不断上升[1]。寄生虫感染、原发性硬化性胆管炎(PSC)、胆管囊肿和结石是ECC发生的危险因素[2]。肠道菌群占人体所有共生微生物的绝大多数，其种类超过1000种，细胞总数约1014，是人体自身细胞数量的10倍[3]，对机体代谢、免疫等功能具有重要的调节作用[4]。体内外各种有害刺激因素都会导致肠道菌群发生紊乱，对机体产生严重损害。肠道菌群紊乱与慢性肝病、肝硬化和肝癌的形成发展密切相关，被形象地称为“肠-肝”轴[5-6]。本研究拟通过菌群16S rRNA绝对定量测序分析ECC患者肠道菌群变化，从菌群角度为ECC诊断和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2020年1月—2020年12月于郑州大学第一附属医院肝胆胰外科住院治疗的ECC患者16例(ECC组)，诊断符合2020年美国国立综合癌症网络肝胆肿瘤临床实践指南(V1版)[7]标准；胆总管结石(common bile duct stones,CBDS)患者20例(CBDS组)，诊断符合2017年胆总管结石管理指南[8]；同期在本院体检的健康成人10例(Normal组)。排除标准：(1)ECC组排除肝内胆管癌、肝癌患者；确诊为ECC但是以往接受过手术或介入治疗的患者。(2)CBDS组排除胆囊结石和肝内胆管结石患者。(3)有其他恶性肿瘤；信息不完全；滥用酒精；既往消化道疾病史或消化道手术史；免疫系统疾病以及其他与肠道菌群相关的疾病(如炎症性肠病、糖尿病)。

1.2 样品采集及DNA提取 晨起后排便于无菌容器，使用一次性采集勺取适量样品于无菌采集管中，置于冰盒中迅速送至实验室，分装后置于-80 ℃冰箱保存，保存时间小于1个月。按QIAamp®Fast DNA Stool Mini Kit(Germany, Qiagen)说明书提取粪便菌群总DNA，NanoDrop2000(USA, Thermo Fisher Scientific)检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

1.3 16S rRNA可变区扩增及测序 选取16S rRNA V3-V4可变区进行PCR扩增，引物为F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。利用带有Index序列的引物，通过高保真PCR向文库末端引入特异性标签序列，经纯化后(Agencourt AMPure XP，USA)，得到原始文库。再利用Invitrogen对文库进行精确定量(Qubit 3.0，USA)，根据不同样本的测序通量要求，按相应摩尔比混合样本。使用生物分析仪(Agilent 2100，USA)评估DNA文库的质量和检测插入物的大小，所有样品插入物的大小在120～200 bp。合格后通过使用Illumina NovaSeq(Illumina，USA)台式序列仪，用2×250 bp配对末端方法进行16S rRNA基因扩增子的测序。

1.4 数据信息分析 首先对原始下机数据进行质控和过滤(QIIME2，2019.10)，使用优化的有效序列进行ASVs(Amplicon sequence variants)分类分析。标记spike-in序列，并统计各个样本spike-in序列比例。根据每个样本spike-in序列数和拷贝数信息制作标准曲线方程，计算得到每个样本中各个ASVs的绝对拷贝数(不含spike-in序列)。ASVs的分类学物种注释，默认使用RDP数据库(https://rrndb.umms.med.umich.edu/)。Alpha多样性分析使用MOTHUR软件进行，群落组成分析使用MOTHUR和R软件完成。Beta多样性分析和组间显著差异的物种，主要使用R和Lefse软件完成。差异菌群与环境因子的相关性分析采用Spearman分析。

1.5 伦理学审查 本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，批号： 2020-KY-369，患者及家属均签署知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 ECC组TBil、DBil、ALP和GGT明显高于CBDS组(P值均<0.05)。在药物使用方面，ECC组使用过或正在使用抑酸药、保肝药和抗生素的例数分别为4例、4例、3例，与CBDS组(7例、10例、9例)比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)，ECC组使用抑酸药、保肝药和抗生素的天数与CBDS组相比差异均无统计学意义(P值均>0.05)。另外，ECC组有2例接受过经皮肝穿刺胆道引流术(percutaneous transhepatic cholangial drainage,PTCD)减黄。ECC组与Normal组比较，肝功能指标差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

2.2 测序深度评估 分别从样本中随机抽取出一部分序列，以抽到的序列数与它们所能代表ASVs的数目构建稀释性曲线。可见曲线随着抽取序列数的增加而趋于平缓，说明样本的测序数据量合理, 足以覆盖大多数微生物(图1)。

2.3 肠道菌群多样性分析 多样性是描述样本物种总数和多样性的指标，主要包括 Observed species、Chao1指数、Shannon指数、ACE指数和Simpson指数。Observed species显示3组间物种总数未发生明显变化，Chao1指数和ACE指数显示3组间物种多样性无明显差异，而 Shannon指数和Simpson指数显示3组物种多样性有明显差异，ECC组物种多样性与Normal组相似，但高于CBDS组；CBDS组高于Normal组(表2)。多样性反映的是组间菌群组成差异，本文采用主坐标分析(PCoA)来直观显示，如图2所示，3组样本区域尽管在X轴与Y轴上存在一定重合，但3组中心存在距离，因此3组间菌群构成存在差异。

图2 组间PCoA分析

2.4 差异菌属鉴定 3组差异菌属鉴定如图3所示：Citrobacter在Normal组中的含量显著高于ECC组和CBDS组(P<0.001)。Paraprevotella和Flavonifractor在Normal组中的含量显著高于ECC组和CBDS组(P值均<0.01)。此外，在Normal组中Bilophila、Bacteroides、Fusicatenibacter、Megamonas、Alistipes和Anaerofilum的含量

表1 3组一般资料比较

表2 3组间菌群多样性的比较

增加，与ECC组和CBDS组相比，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。Allobaculum在CBDS组中的含量与ECC组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。CBDS组和ECC组Sutterella的含量与Normal组相比，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

2.5 3组菌群组成差异性分析 线性判别分析(LEfSe)显示，在门水平上，ECC组和Normal组中无代表性的菌门，而Verrucomicrobia在CBDS组明显富集。在科水平上，Lactobacillaceae和Prevotellaceae在ECC组中明显增多，Enterococcaceae和Verrucomicrobiaceae在CBDS组中明显增多，而在Normal组中Veillonellaceae和Campylobacteraceae明显富集。在属类水平上，ECC组中显著差异的菌属是Prevotella、Lactobacillus、Megasphaera、Sutterella、Alloprevotella.s__uncultured_Bacteroidetes_bacterium和Prevotella.s__uncultured_Bacteroidetes_bacterium，Normal组中显著差异的菌属是Flavonifractor、Fusicatenibacter、Allisonella、Allisonella.s__uncultured_bacterium、Campylobacter和Romboutsia。除此之外，Enterococcus、Akkermansia、Allobaculum.s__uncultured_bacterium和Allobaculum是CBDS组中显著差异的菌属(图4)。

注：*，与Normal组比较，P<0.05；#，与CBDS组比较，P<0.05。

2.6 菌群与临床指标的相关性分析Prevotella与抗生素、抑酸药和保肝药的使用呈负相关。Lactobacillus、Megasphaera、Sutterella与TBil和DBil呈正相关，此外，Lactobacillus还与AST、ALT、ALP、GGT和年龄呈正相关，Megasphaera和ALP呈正相关，Sutterella与AST呈正相关(附件1)。

注:a，不同的颜色表示不同分组,除黄色节点表示的是在组间绝对定量并无显著差异的物种外,树枝中其他3种颜色节点表示在对应组别中绝对定量显著高的物种, 节点直径大小与丰度大小呈正比;b，不同颜色的条形表示不同组别中LDA score(log10)大于2且在该组中丰度显著高的差异物种,条形图的长短代表的是LDA score值大小。

3 讨论

胆管癌是一种侵袭性高且预后差的肿瘤，根治性手术切除是首选治疗方法，但多数患者就诊时已是晚期，能根治性切除的仅占35%[1]。ECC是胆管癌最常见的类型，占比约75%[9]，5年生存率在20%～30%[10]。最近研究[11]表明胆管癌患者肠道菌群明显发生紊乱，但对ECC患者肠道菌群变化还未见相关研究。

本研究结果表明无论是多样性分析或菌群差异分析，均提示ECC菌群构成发生了明显改变。首先，ECC组的多样性与Normal组相似，却高于CBDS组，Chen等[12]同样发现远端胆管癌患者肠道菌群多样性明显高于胆总管结石患者。其次在多样性的分析中，ECC组的菌群结构与CBDS组和Noaml组明显不同，这与Lee等[11]和Avilés-Jiménez等[13]研究的结果一致。此外，与ECC组和Normal组相比，CBDS组物种多样性明显减少，有研究[14]报道称与健康人群相比，胆总管结石患者肠道菌群多样性明显减低，且肠道菌群紊乱与胆总管结石形成密切相关，其机制可能是通过影响胆汁酸和胆固醇代谢导致。

Proteobacteria大多为条件性致病菌，是脂多糖主要生成来源，与炎症反应密切相关，且大鼠中脂多糖暴露会导致快速的肝损伤[15]。本研究结果显示，ECC组中Sutterella(Proteobacteria的成员)明显富集且Sutterella的占比与TBil、DBil呈正相关。说明炎症反应在ECC的疾病演化中仍扮演重要角色，但炎症反应程度可能较CBDS轻缓，持续时间长。Sutterella对人胆汁酸具有较强抵抗力，这可能是其在胆道和肠道中存活的原因[15]。此外，Sutterella在十二指肠中含量最高，从十二指肠至结肠梯度递减，具有轻度的促炎能力[16-17]。

Bacteroidetes大约有7000个不同物种，是最大的革兰阴性菌门类[18]。Prevotella是其主要菌属[19]，笔者发现Prevotella在ECC组明显富集。Prevotella是辅助性T淋巴细胞(Th)17的强诱导剂，肠道Th17迁移可促进肿瘤发生发展[20-21]，推测Prevotella诱导Th17的活化是ECC发生发展的一个重要环节。Vich等[22]的研究表明除抗生素外，抑酸药也会影响肠道菌群的多样性和物种结构。有研究[23]指出抑酸药可以通过提高胃肠道pH值抑制Prevotella，另外在一项研究[24]中发现抗生素治疗后患者肠道菌群的Bacteroidetes明显减少，同样本研究结果也显示抑酸药、抗生素与Bacteroidetes中的Prevotella呈负相关。本研究还发现Lactobacillus和Megasphaera在ECC组中明显增加，且与TBil、DBil等肝功能指标呈正相关，说明两者也与ECC疾病进展密切相关。Lactobacillus可以将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸[25]，报道[26-27]显示次级胆汁酸增多是胆管癌变的重要因素。ECC组Lactobacillus增加会代谢生成更多的次级胆汁酸，促进ECC的发生发展。Megasphaera是瘤胃微生物组的重要成员，正常情况下可生成短链脂肪酸，对肠道屏障功能具有保护作用[28]。Megasphaera扩增也可诱发炎症反应，从癌前病变至实性癌灶中均检测到Megasphaera。已经有研究者[29]提出Megasphaera在促进子宫宫颈发育异常和宫颈上皮内瘤变中起着重要作用，另有研究[30]发现与口腔癌患者相比，Megasphaera在口腔黏膜白斑患者中丰度也明显增加。Cortez等[31]发现在PSC中Megasphaera丰度增加，且Megasphaera与TBil、GGT呈正相关。而PSC是ECC常见的高危因素，本研究描述了Megasphaera在ECC组明显增多，这可能为进一步研究Megasphaera与ECC发生发展之间的关系提供一定的线索。Wu等[32]进一步发现Megasphaera可通过影响氨基酸代谢参与癌症疾病进展。

当然，本研究局限性在于样本数量较少，未来也会扩大样本量进一步研究探索肠道菌群变化与ECC的潜在联系。

综上所述，本研究表明，ECC患者肠道菌群发生明显改变，表现为Prevotella、Lactobacillus、Megasphaera、Sutterella明显增多，且ECC患者肠道菌群改变与肝功能和药物的使用密切相关。该研究将为从肠道菌群角度预防或治疗ECC提供研究基础。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：李涛、王盼梁负责课题设计，资料分析，撰写论文；袁梓博、冯泉凯参与收集数据，修改论文；李捷负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。

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