人网膜脂肪干细胞与小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1体外增殖分化对比观察

李肖晓，刘波，阿尔孜古丽∙吐尔逊，张明琛

1新疆医科大学健康管理学院，乌鲁木齐 830000；2新疆医科大学第一附属医院临床研究院；3中国科学院大学附属宁波市华美医院内分泌科

人体脂肪组织具有可塑性，随着体质量增加、年龄增长，脂肪组织扩张，脂肪细胞的体积增大数目增多［1］。内脏脂肪组织不仅是人体供能组织，还是重要的内分泌器官。内脏脂肪增加后，募集巨噬细胞等多种免疫细胞、分泌多种炎症因子、免疫调节因子［2］，激活体内炎症氧化反应，促进了糖尿病、非酒精性脂肪肝病、冠心病等多种代谢性疾病的发生发展［3］。小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）是一种脂肪干细胞、前体脂肪细胞，3T3-L1及其亚克隆系3T3-F442A［4］，以及辛普森变异综合征婴儿皮下脂肪干细胞［5］、成年人皮下脂肪干细胞［6］，都被用于研究脂肪细胞的功能代谢。但由于种属不同或脂肪来源部位差异，这些脂肪细胞模型无法替代人内脏脂肪细胞。若在体外予以适宜处理，人网膜组织即可成为理想的内脏脂肪来源。本研究通过提取人网膜脂肪干细胞，并以3T3-L1作对照，将两种细胞进行培养并诱导分化为成熟脂肪细胞，比较其增殖和分化情况，总结人网膜脂肪干细胞体外增殖分化特点，旨在可为后续研究人内脏脂肪细胞代谢功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 组织来源 选取2021年1—3月新疆医科大学第一附属医院收治的因胆囊炎或胆囊结石需行外科手术治疗的超重或者肥胖患者12例，男7例，女5例；年龄（49.16±14.22）岁。纳入标准：18岁≤年龄<70岁，BMI≥24 kg/m2。排除标准：患有糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、肝肾功能不全及近半年体质量变化>10%者。手术取腹腔内大网膜脂肪组织0.5～2 g。小鼠来源的3T3-L1由新疆医科大学临床医学研究院细胞室提供。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，且患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器 磷酸盐缓冲液（PBS）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Biological Indus‐tries公司），DMEM高糖培养基、胎牛血清、Ⅰ型胶原酶（Gibco公司），青霉素链霉素混合溶液（Hyclone公司），2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐（Cell Counting Kit-8试剂盒，博奥森公司），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、地塞米松、10 mg/mL胰岛素溶液（Sigma公司），油红O染色液（Solarbio公司）。超净工作台，细胞培养箱，上海安亭TDL-5-A离心机，OLYMPUS IX73倒置显微镜，BIO-RAD iMark酶标仪。

1.3 细胞培养基、分化诱导培养基配制 ①细胞培养基：取44.5 mL的DMEM高糖培养基、5 mL胎牛血清、500μL青霉素链霉素溶液，加入50 mL离心管中。②成脂分化诱导培养基：称取IBMX 55.56 mg，加入无水乙醇5 mL，混匀溶解，配成0.05 mmol/mL的IBMX溶液。称取吲哚美辛71.55 mg，加入无水乙醇1.43 mL，混匀溶解，配成0.14 mmol/mL吲哚美辛溶液。称取地塞米松1 mg，加入无水乙醇1 mL，混匀溶解，配成1 mg/mL地塞米松溶液。取556μL的IBMX溶液、35μL吲哚美辛溶液、20μL地塞米松溶液、50μL胰岛素溶液、500μL青霉素链霉素混合溶液、5 mL胎牛血清混合，再加入DMEM高糖培养基定容至50 mL，即配成分化诱导培养基，其中IBMX最终浓度0.5 mmol/L，吲哚美辛最终浓度0.1 mmol/L，地塞米松最终浓度1 mmol/L，胰岛素最终浓度10 mg/L。配成50 mL分化诱导液后，用0.22μm滤器过滤除菌。

1.4 人网膜脂肪干细胞、3T3-L1体外培养及生长情况观察 ①人网膜脂肪干细胞：a.原代培养：取患者的网膜脂肪组织2 g，置于培养皿中，滴加2 mL的PBS、1 mL的青霉素链霉素溶液，清洗大网膜的血迹，使用眼科剪剪去大网膜组织上肉眼可见的血管和纤维，尽量减少血管内皮细胞和成纤维细胞的污染，用眼科镊将0.5～1 cm3大小的脂肪颗粒夹入50 mL离心管，加入两倍体积的Ⅰ型胶原酶溶液（浓度2 mg/mL），移至培养箱，消化30 min。消化组织后，向胶原酶溶液中加入含血清的培养液2 mL终止消化，获得组织消化液，经100μm细胞过滤器，过滤掉油脂、未消化的纤维组织和成熟脂肪细胞，获得脂肪基质细胞悬液，移入15 mL离心管，1 500 r/min速度离心5 min。见管底细胞沉淀，轻轻吸去上清。再加入1 mL的PBS，再次同样转速离心。见管底细胞沉淀，轻轻吸去上清。向细胞沉淀加入1 mL完全培养液，吹打混匀，移入25 cm2培养瓶，加完全培养液至6 mL，移至培养箱。获得的脂肪基质细胞中混有多种细胞，包括具有多能分化潜能的脂肪干细胞、成熟脂肪细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等，因此每日观察细胞贴壁情况，第3天有部分细胞已经贴壁，可以进行半量换液，即吸出旧培养液3 mL，加入新鲜培养液3 mL，继续培养，等待7 d左右，贴壁细胞更多，可以再次换液，换6 mL新鲜培养液。b.传代：原代细胞经过贴壁生长，10 d左右，单层细胞覆盖70%～80%瓶壁，吸除培养瓶中的旧培养基，加入2 mL的PBS漂洗。加入1 mL胰蛋白酶，显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，用移液枪吹打平底细胞，获得细胞悬液，此时加入完全培养液2 mL终止消化。将细胞悬浮液移入15 mL离心管，1 000 r/min速度离心5 min。见管底细胞沉淀，轻轻吸去上清。再加入1 mL PBS，吹打混匀，1 000 r/min速度离心5 min。见管底细胞沉淀，轻轻吸去上清。向细胞沉淀加入1 mL完全培养液，吹打混匀，移入细胞培养瓶，加培养液至6 mL，移至培养箱，等待24 h后，细胞贴壁。②3T3-L1：复苏冻存的3T3-L1，另将500 mL搪瓷杯中注入蒸馏水，放置在电加热套上，加热至水温37℃；从液氮罐中迅速取出冻存管，放入已加热的蒸馏水中；等待1 min，冻存管中的细胞悬液融化；冻存管放入上海安亭TDL-5-A离心机，1 000 r/min速度离心5 min；从离心机中取出冻存管，外喷75%酒精后，灭菌纱布擦拭冻存管，置于超净台上；用移液枪小心吸除冻存管上层液体，留下下层细胞沉淀；再向冻存管中加入1 mL细胞培养基，吹打成细胞悬液；移液枪吸取细胞悬液移入25 cm2细胞培养瓶，再加入5 mL细胞培养基；将细胞培养瓶放入细胞培养箱；24 h后予以换液；72 h后3T3-L1密布于培养瓶底，予以传代。

1.5 人网膜脂肪干细胞、3T3-L1增殖曲线绘制 ①人网膜脂肪干细胞：取培养成功的第2代人网膜脂肪干细胞，制成细胞悬液，按4×104/孔接种于96孔板，设3个复孔为一组，共10组，每天测一组细胞的吸光值。24 h后细胞贴壁，选择第一组细胞，每孔换新鲜培养基100μL、加10μL的CCK-8溶液（四唑盐溶液），另设3个无细胞对照孔，加等体积的培养液和CCK-8溶液；其余暂未测定的细胞，也需每日换液，每孔100μL培养基。37℃孵育2 h，其中四唑盐被细胞线粒体的脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜，可以直接测定吸光值。②3T3-L1：复苏冻存的3T3-L1，制成细胞悬液，按4×104/孔接种于96孔板，复孔和组数的设置、每孔加入的新鲜培养基、CCK-8溶液均与人网膜脂肪干细胞的处理方法相同。每日测定两种细胞及无细胞对照孔的吸光度值。选择波长450 nm，酶标仪测定各孔吸光度值。以时间（天）为横轴，吸光值为纵轴绘制生长曲线。

1.6 人网膜脂肪干细胞、3T3-L1油红O染色 ①人网膜脂肪干细胞：取生长良好的第2代人网膜脂肪干细胞，用胰蛋白酶消化后，细胞计数板下计数，按1×105个/孔接种接种入6孔板，24 h后细胞贴壁，更换为分化培养液（2 mL/孔），每2 d换液1次，每天观察转化情况，至第10天，诱导成熟，进行油红O染色。移除细胞培养基，用PBS洗两次，加油红O固定液固定20～30 min。弃去固定液，用蒸馏水洗2次。加入60%异丙醇浸洗5 min，弃去60%异丙醇后加入新配制好的油红O染液，浸染10～20 min。弃去染色液，水洗2～5次，直到无多余染液。加入苏木素染色液，复染核1 min。弃去染液后水洗2～5次。加入油红O缓冲液1 min，弃去。加入蒸馏水1 mL覆盖细胞并在显微镜下观察。②3T3-L1：复苏冻存的3T3-L1，制成细胞悬液，按1×105/孔接种于6孔板，24 h后细胞贴壁，更换为分化培养液（2 mL/孔），每2 d换液1次，每天观察转化情况，至第10 d，诱导成熟，进行油红O染色。油红O染色步骤与人网膜脂肪干细胞的处理方法相同。

2 结果

2.1 人网膜脂肪干细胞、3T3-L1生长情况比较 ①人网膜脂肪组织消化液经离心后，获得1×105～2×105个细胞，接种入25 cm2细胞培养瓶，贴壁时间为48～72 h，经过贴壁筛选和换液，贴壁细胞以脂肪干细胞为主，呈片增殖（图1A），再经过48 h，显微镜下观察贴壁细胞为圆形、类圆形、梭形、多角形（图1B），生长良好的细胞可以覆盖细胞培养瓶面积的80%，此时传代。第1代细胞24 h之内贴壁，细胞形态多为梭形、多角形（图1C），培养4 d后细胞覆盖培养瓶70%～80%，再次传代比例为1︰1或者1︰2，即1瓶细胞消化脱壁后，制成细胞悬液，分装入1瓶或者2瓶。第2代、第3代和1代倍增时间相似。细胞传至第4代时，细胞增殖缓慢，贴壁生长4天细胞形态出现老化，细胞形态扁平，细胞质内颗粒增多（图1D）。②冻存的3T3-L1复苏24 h贴壁，细胞形态为多角形（图1E），48 h增殖的细胞排列更为紧密，覆盖培养瓶底90%以上（图1F），72 h可以传代。

2.2 人网膜脂肪干细胞、3T3-L1增殖曲线比较 ①人网膜脂肪干细胞第3代接种第1天，吸光值略升高，说明细胞缓慢生长；第2～5天吸光值逐渐升高，为指数增长期；第6～8天吸光值在3.2左右，为平台期；第9天吸光值迅速下降，细胞开始衰亡。②3T3-L1接种后48 h，吸光值升高曲线如指数函数，细胞倍增时间为48 h，第3天进入平台期，吸光值在3.2～3.6，详见图2。

2.3 人网膜脂肪干细胞、3T3-L1分化后油红染色比较 经过10天诱导分化，人网膜脂肪干细胞与3T3-L1脂肪细胞中均出现串珠状小脂滴、有的细胞中为大脂滴，用油红O染色，脂滴被染成红色，约80%的细胞可见比较密集的红染的脂滴（图3A、B）。在10天诱导过程中，两种贴壁的脂肪干细胞出现漂浮、凋亡，人网膜脂肪干细胞凋亡较明显。

3 讨论

随着肥胖的发生发展，内脏脂肪体积增加同时伴随分泌功能异常，导致机体内慢性炎症反应、氧化应激增加、发生胰岛素抵抗。内脏脂肪细胞功能的研究是目前很多代谢性疾病研究热点。3T3-L1及其亚克隆系源自瑞士Swiss鼠的胚胎干细胞，具有多向分化功能，是目前最常使用的脂肪细胞模型，但3T3-L1分化为成熟脂肪细胞后，代谢特点不能完全模拟人内脏脂肪细胞。人的脂肪干细胞来源不同，功能也不同。内脏与皮下的脂肪干细胞比较，内脏脂肪干细胞分泌更多的肿瘤坏死因子α、白介素6、单核细胞趋化蛋白等炎症因子［7］，可诱导胰岛素抵抗发生。从内脏脂肪组织提取前脂肪细胞，将前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞［8］，是研究代谢性疾病的最佳细胞模型。

图3 诱导成功的人网膜脂肪细胞和3T3-L1脂肪细胞油红O染色

本实验成功从人网膜脂肪组织提取脂肪干细胞、并诱导为成熟脂肪细胞，原代细胞的贴壁生长时间、传代次数与盛志峰等［8］的研究基本一致。但提取的脂肪干细胞数目、脂肪干细胞培养基、成脂诱导分化液成分、成脂诱导时间各个文献中差别较大。脂肪组织消化液中的细胞数目越多，原代培养成功率越高，有文献报道需要大网膜脂肪组织质量为10～40 g［9-10］，但获取人体网膜脂肪组织存在一定风险。本研究显示，0.5 g网膜组织可提取原代细胞数目可达1×105以上。Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织中的胶原纤维，加速脂肪细胞的解离。既往研究显示，胶原酶消化时间1～1.5 h［11］，为了减少胶原酶对细胞的伤害，本研究控制消化时间为30 min为宜。

李彩霞等［12］使用超高相质谱—色谱技术分析胎牛血清的成分，发现其中含有促进细胞黏附、增殖、分化的细胞因子。本实验使用细胞培养基含有体积分数10%的胎牛血清，原代细胞和4代之内的细胞贴壁和增殖良好，因此脂肪干细胞培养基中加入胎牛血清，可以促进细胞贴壁生长。但传至4代的细胞较早出现老化形态，增殖缓慢。而KOCAOEMER等［13］使用胎牛血清替代物培养人脂肪干细胞，传至3～4代，细胞增殖速度明显高于胎牛血清培养组，并且细胞形态正常，未见老化细胞。尽管胎牛血清是脂肪干细胞最常用的培养基补充剂，但是由于异种血清中病原微生物和抗原对人类脂肪干细胞的免疫刺激，加速干细胞凋亡，更多的研究者使用胎牛血清替代品培养增殖力旺盛的脂肪干细胞［14］。本实验在诱导脂肪干细胞过程中，加入分化诱导培养基后，每天拍照观察，第3～4天脂肪干细胞由梭形变为类圆形，细胞质内出现串珠样小脂滴，但此时每天使用基础细胞培养基，细胞质内的脂滴逐渐消失，所以为了使得干细胞持续分化，积累脂滴，本实验每2天更换新鲜诱导培养基，维持10 d，取得良好效果。在10天诱导过程中，部分细胞脱壁漂浮，降低了成熟脂肪细胞产量，分析其原因可能为异种血清中细胞因子干扰脂肪干细胞分化的信号通路、有机溶剂乙醇的细胞毒性。有研究［15］使用无血清成脂诱导方法，减少肽牛血清中异种抗原对干细胞的免疫刺激。无血清诱导分化液中除了细胞生长必须的营养素和细胞成脂分化必须的胰岛素、地塞米松和IBMX，还有抗氧化物质；有研究发现明胶和脂肪干细胞共培养可以更好的保持细胞活性［16］，VOLZ等［17］使用Ⅰ型胶原覆盖细胞培养板，然后接种脂肪干细胞进行诱导分化，可以显著增加细胞黏附和活性。

总之，人网膜脂肪干细胞具有分化为成熟脂肪细胞的能力，但增殖能力有限。随着体外培养技术的改良，人网膜脂肪干细胞将有更广阔的应用前景。