HBV多聚酶基因P区单位点和多位点突变、低中高HBV DNA载量、轻中重度的CHB患者外周血T淋巴细胞亚群观察

杨莉，侯军良，冯爱东，刘腾飞，许怡

石家庄市第五医院检验科，石家庄 050021

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，全球感染人数约有2.57亿人，其中约有88.7万人死于相关疾病［1］。核苷（酸）类似物（NAs）通过抑制HBV聚合酶活性达到强效的抑制病毒复制作用，有用法方便及不良反应少等特点，是慢性乙型肝炎（CHB）患者优先选择的治疗方案，但长期、广泛应用会诱发HBV多聚酶基因逆转录保守区（P区）位点突变，使HBV对该类NAs出现耐药，导致病情反弹［2-4］。CHB是一种免疫相关性疾病，HBV通过诱发机体的免疫反应间接地损伤肝细胞。CHB患者的机体免疫调节功能紊乱导致CD3+、CD4+T淋巴细胞显著降低，所以T淋巴细胞亚群是治疗CHB时人们常关注的指标［5-6］。那么CHB患者体内HBV发生耐药基因突变时，T淋巴细胞亚群的状态是怎样的，有那些因素影响T淋巴细胞亚群的功能，这方面的研究目前较少。本研究通过观察CHB患者经NAs治疗发生病毒P区耐药基因突变后，患者体内T淋巴细胞亚群变化，探讨HBV发生P区耐药基因突变后对慢性乙肝患者T淋巴细胞亚群的影响，为减缓或阻止患者机体耐药性的出现提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年10月—2019年3月石家庄市第五医院收治的CHB患者61例，男41例，女20例；年龄23～78（51.4±11.6）岁。诊断依据中华医学会肝病学分会与中华医学会感染病学分会联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》［7］，所有患者入选前均未用过抗病毒药和免疫调节剂，且半年内未用过降酶药，血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均为阴性。所有患者通过基因测序技术确认所感染HBV发生病毒耐药基因突变，根据病毒基因突变位点的个数分为单位点者（29例，只有一个基因位点发生突变）和多位点者（32例，有两个或以上基因位点发生突变），根据HBV DNA载量分为低拷贝者（6例，HBV病毒载量拷贝数为102～103）、中拷贝者（22例，HBV病毒载量拷贝数为104～105）、高拷贝者（33例，HBV病毒载量拷贝数为106～108），根据患者病情程度分为轻度者（12例）、中度者（25例）、重度者（24例）。另选取30例健康人群为对照，男21例，女9例；年龄21～78（49.3±19.1）岁；纳入标准为外周血肝功能完全正常且病毒标志物全阴。

1.2 T淋巴细胞亚群检测方法 无菌抽取EDTA抗凝血2 mL，用于T细胞表面标志的检测，同时抽取外周静脉血3 mL，离心5 min，分离血浆，用于HBV DNA载量、基因型及耐药突变核酸测序的检测。吸取10μL的白细胞分化抗原CD3+、CD4+、CD8+检测试剂，加入无添加试管，将患者待测EDTA抗凝血充分混合后吸取100μL加入试管，在快速混匀器上震荡混合，37℃避光孵育15 min，加入2 mL溶血素，震荡混匀后，37℃避光孵育15 min，待液面清亮，以1 500 r/min速度离心5 min，弃上清，加入2 mL的0.9%生理盐水，再次震荡混匀，以1 500 r/min的速度离心5 min，弃上清，吸取400μL鞘液加入试管，充分震荡混匀，使用流式细胞仪检测T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+。

1.3 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB患者HBV耐药基因突变前后、健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较 CHB患者HBV发生耐药基因突变前后、健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较见表1。

表1 CHB患者突变前后、健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较（%，±s）

表1 CHB患者突变前后、健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较（%，±s）

注：与健康人群比较，aP<0.05；与CHB患者突变前比较，bP<0.05。

入选对象CHB患者突变前CHB患者突变后健康人群n 61 61 30 CD3+T 67.233±11.557a 57.843±13.763ab 71.337±5.234 CD4+T 36.920±9.503a 28.802±9.727ab 40.913±5.526 CD8+T 25.505±7.427a 25.172±9.769a 27.795±6.117

2.2 不同位点HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较 不同位点HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞见表2。由表2可知，不同位点CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较均无显著性差异（P均>0.05）。

表2 不同位点HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞（%，±s）

表2 不同位点HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞（%，±s）

CHB患者单位点者多位点者n 29 32 CD3+T 63.559±9.044 61.242±13.704 CD4+T 34.459±8.102 32.555±9.599 CD8+T 24.266±6.117 23.818±6.996

2.3 不同HBV DNA载量HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较 不同HBV DNA载量HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞见表3。由表3可知，不同HBV DNA载量CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较均无统计学差异（P均>0.05）。

表3 不同HBV DNA载量HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较（%，±s）

表3 不同HBV DNA载量HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较（%，±s）

CHB患者低拷贝者中拷贝者高拷贝者n6 22 33 CD3+T 62.625±8.386 62.179±12.041 60.532±14.846 CD4+T 35.425±2.666 32.821±8.686 33.220±10.241 CD8+T 22.575±7.705 25.364±5.660 22.000±7.708

2.4 不同病情HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较不同病情HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较见表4。

表4 不同病情HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较（%，±s）

表4 不同病情HBV多聚酶基因P区位点突变后CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较（%，±s）

注：与中度者比较，bP<0.05。

CHB患者轻度者中度者重度者n 12 25 24 CD3+T 61.642±12.254 60.992±8.968 52.663±17.092b CD4+T 32.575±9.997 28.928±7.554 26.783±11.303 CD8+T 25.208±10.042 27.928±9.312 22.283±9.659b

3 讨论

CHB是常见的慢性传染病之一，严重危害人民健康［8］。治疗HBV的药物主要是NAs、干扰素及中草药［9］，国内常用的NAs有LAM、ADV、恩替卡韦（ENV）及替比夫定（LdT）［10］。NAs可在患者体内形成三磷酸活性成分结合到HBV聚合酶上，抑制HBV的复制［11］。而随着用药人群基数增大和用药时间延长可导致HBV发生基因变异特别是HBV逆转录酶区的基因变异，从而导致产生的HBV聚合酶与NAs结合力降低，即变异的HBV不受NAs的抑制或抑制能力下降，在继续应用同一种NAs治疗的情况下，HBV变异株因对NAs不敏感而逐渐代替野生株，成为患者体内的优势株，从而导致患者对于NAs的耐药，发生病毒学反弹和血清学突破［12-13］。目前，临床主要采取基因芯片技术和Sanger测序法对HBV主要的耐药位点进行检测，监测和指导临床CHB治疗［14］。

外周血T淋巴细胞亚群是反映HBV感染后各种临床类型肝病细胞免疫状态的重要指标，T淋巴细胞亚群比例失调，对HBV的清除作用减弱，成为HBV复制及病情变化的主要原因［15］。T淋巴细胞亚群中，CD3+是成熟T细胞的共同分化抗原，代表外周血T细胞的总量，作为T细胞的识别单位，参与特异性抗原的识别，它的减少表示患者体内T淋巴细胞的数量减少，可能是参与免疫反应而不断“消耗”所致，CD3+T淋巴细胞减少的越明显越不利于病情的改善［16］。而CD4+主要表达于T细胞的辅助细胞和抑制细胞的表面，在细胞免疫和体液免疫反应中起协调作用，在免疫应答中起中心作用；CD8+T淋巴细胞分布于杀伤性T淋巴细胞表面的，在被细胞因子激活后，产生穿孔素和颗粒酶破坏靶细胞，是机体清除细胞内病毒的主要机制［17］。有研究发现，CHB患者由于CD4+T淋巴细胞数量明显下降，可导致HBV特异性CD8+T淋巴细胞减少，对HBV的清除力减弱［18］。

本研究对乙肝患者体内病毒发生耐药基因突变前后患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞进行比较，发现乙肝患者突变前CD3+、CD4+T淋巴细胞均低于正常组，且发生耐药基因突变后CD3+、CD4+T淋巴细胞相比突变前明显降低，此结果表明CHB患者体内持续存在着HBV感染，对机体CD3+T淋巴细胞不断消耗，CD4+T淋巴细胞功能亦减弱，对HBV的清除作用减弱，尤其是发生耐药突变后，致使CD3+、CD4+T淋巴细胞功能进一步减弱，即T淋巴细胞清除HBV的能力进一步减弱，HBV病毒增殖不受抑制，所以易发生病毒学反弹。另外在本研究中将这61位患者在确认体内HBV发生耐药基因突变后，按照患者病情轻重进行分组发现，随病情加重，CHB患者的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的均呈现降低的趋势，三组之间比较，轻、中度差异不大，主要是CD3+、CD4+T淋巴细胞降低，但是重度者CD3+、CD8+T淋巴细胞较中度者明显下降，且差异具有统计学意义。这表明发生耐药基因突变后，在病情反弹早期，即轻、中度阶段，患者机体T淋巴细胞亚群主要是CD3+、CD4+T淋巴细胞的不断被消耗，CD4+T淋巴细胞所协调的免疫应答的功能不断降低，导致对HBV清除能力进一步降低，而随病情加重，最终导致更多CD8+T淋巴细胞的参与到清除病毒的反应中，通过细胞免疫进行清除病毒，所以病情严重时CD8+T淋巴细胞消耗严重，从而导致病毒增殖进一步活跃，导致病情加重，所以CD8+T淋巴细胞功能受损可能是乙肝患者机体发生耐药后病情加重的机制之一。

研究［19］显示，CHB出现病毒基因突变发生耐药主要以单一位点突变模式为主，但是也出现了多位点混合突变的模式。本研究发现，单位点者与多位点者相比，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞随耐药基因突变位点增多相比呈下降趋势，表明CHB患者T淋巴细胞随突变基因位点增多而消耗增多，导致病毒复制活跃。而HBV病毒载量的高低与特异性T淋巴细胞呈负相关［20］。本研究将所有CHB患者按HBV DNA复制量的大小进一步分组比较，低、中、高各复制组CD3+、CD4+T淋巴细胞呈逐渐下降的趋势，CD8+T淋巴细胞。从研究结果分析随病毒复制量增加，CD3+、CD4+T淋巴细胞不断消耗增多，但是随病毒增殖活跃，CD8+T淋巴细胞被大量激活使增高，但是如果病毒没被抑制，则由于病毒大量复制被大量消耗，导致CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫反应受损，所以病毒复制更加活跃，促使病情加重。

总之，CHB患者感染HBV后，体内外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞的明显降低，当HBV发生耐药基因突变后，患者体内CD3+、CD4+T淋巴细胞进一步降低，对HBV的清除能力降低，而且发生HBV耐药基因突变后，随病情不断加重，患者CD3+、CD4+T淋巴细胞的消耗不断增多，尤其在病情严重期，患者CD8+T淋巴细胞亦消耗增多；另外随突变位点数目增多，病毒载量增高，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞均呈降低趋势，所以患者在抗病毒治疗过程中应定期监测CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞，尤其是CD4+T淋巴细胞，当发现CD3+、CD4+T淋巴细胞降低明显，病毒反弹，应考虑有基因突变的发生，以便及时调整治疗方案，在患者病情处于轻度、中度时及时采取免疫疗法，激活患者机体免疫细胞的功能，尤其是CD8+T淋巴细胞的功能，应该更有利于清除发生耐药基因突变的病毒，甚至可能延缓或防止耐药的发生，这是一条CHB患者抗病毒治疗的思路，还需进一步研究。