基于网络药理学探讨白藜芦醇抗衰老的作用机制#

曾宇鑫 汪梦 张晓 梁楠

（成都医学院基础医学实验教学中心，四川 成都 610500）

衰老主要表现为机体功能的衰退、身体适应力减退。全球人口老龄化的趋势迫切需要人们更好地了解衰老的过程，从而找寻预防、延迟或减轻其发展的策略[1-2]。目前认为，氧化应激和炎症激活是引起衰老的主要原因[3]。

白藜芦醇（Resveratrol，Res）具有抗衰老、抗肿瘤等多种生物活性[4-6]可用于治疗多种与年龄有关的疾病，例如阿尔茨海默氏病[7-8]、血脂异常[9]，同时具有预防衰老延长寿命的作用[10-11]，然而其抗衰老的机制还不十分清楚。

网络药理学是基于药物结构及其作用靶点与疾病相关靶点之间的生物系统的网络分析，可以预测药物治疗疾病的关键靶点和机制。因此，运用网络药理学研究Res抗衰老作用机制具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 Res作用靶点的获取

在美国国家生物技术信息中心负责维护的Pubchems数据库（https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找Res的3D化学结构。在华东理工大学开发与维护的药效团匹配与潜在识别靶标平台PharmMapper数据库（http: //www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）中[12]，通过Res的3D化学结构搜索目标仅为人类的相关蛋白质，以标准化拟合得分（Normalized Fit Score）≥0.4和z分数≥0.4为筛选条件，得到Res作用靶点，通过UniProt数据库转化为对应的基因名（Gene names）。

1.2 疾病相关靶点的获取

GeneCard数据库（https: //www.genecards.org/）收录了关于人的蛋白质编码基因、RNA基因、遗传基因座、基因簇和未分类的基因等详细信息，在GeneCards数据库中[13]，我们输入关键词衰老（Aging），以相关性得分（Relevance score）≥20.00为筛选条件查询得到衰老相关靶点。

1.3 Res抗衰老靶点

在Venny图在线绘制工具（https: // bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中，分别输入搜索的Res作用靶点、衰老相关靶点到 Res、衰老下面的栏目，两者之间的交集即为Res抗衰老的潜在靶点。

1.4 PPI网络图的构建与分析

将Res抗衰老的潜在靶点导入String数据库（https: //string-db.org/）[14]，限定物种为人，置信度设置为0.4，制作蛋白互相作用（protein-pro tein interaction，PPI）图后下载图片和网络数据表格。统计各个基因在网络数据表格中出现的次数，并绘制柱状图。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析

将Res抗衰老的潜在靶点导入DAVID数据库（https: //david.ncifcrf.gov/）[15]，选择物种为人，下载基因本体论中（Gene Ontology，GO）分析中的生物学过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cel-lular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）富集分析结果，并下载京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析结果，利用微生信在线绘图网站（http: // www.bioinformatics.com.cn/）制作GO富集分析柱状图和KEGG通路分析气泡图。

1.6 构建“药物-疾病-靶点-GO-KEGG通路”网络

将 Res抗衰老的潜在治疗靶点，取前 20条KEGG通路分析结果、前10条GO（BP，CC，MF）富集分析结果导入Cytoscape3.8.0软件，构建“药物-疾病-靶点-GO-KEGG通路”网络。

2 结果

2.1 Res作用靶点

从PharmMapper数据库中获得目标仅为人类的Res相关蛋白质总计224个。以标准化拟合得分（Normalized Fit Score）≥0.4和z分数≥0.4为筛选条件，筛选后经 UniProt数据库转换名称后我们得到91个匹配靶点。

2.2 衰老相关靶点

我们从 GeneCard数据库中获得衰老相关靶点共有24457个，以Relevance score≥20.00为筛选条件，筛选后得到474个衰老相关靶点。

2.3 Res抗衰老潜在靶点分析

将Res作用靶点和衰老相关靶点取交集后，我们得到22个Res抗衰老的潜在靶点，见图1，分别为 ESR1、ALB、NOS3、AR、ANXA5、EGFR、CDK6、SRC、NR3C2、SOD2、PTPN11、F2、SERPINA1、MAPK10、PLAU、ERBB4、MET、ARSA、JAK2、FGFR1、MAPK1、IGF1，见表1。

表1 Res抗衰老潜在靶点

图1 Res抗衰老潜在靶点的Venny图

2.4 PPI网络分析

将Res潜在靶点导入String数据库，分析PPI网络图，EGFR 、MAPK1、MET、ESR1、SRC、IGF1占据核心位置，见图2。在PPI网络中，靶点互相关联节点数最高的 5名是 IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR，见图3，并且它们都与SIRT1有联系，见图3。

图2 Res抗衰老潜在靶点的蛋白相互作用网络图

图3 PPI网络中各个节点关联度柱状图（左）和Res抗衰老潜在靶点的蛋白互相作用网络图（右）

2.5 GO富集分析

GO富集分析中的生物学过程分析结果前 3条分别为信号转导、肽基酪氨酸磷酸化、磷脂酰肌醇 3-激酶信号的正调控；GO富集分析中的细胞定位分析结果前3条分别为细胞核、受体复合物、细胞外区；GO富集分析中的分子功能分析结果前3条分别蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质结合、磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸3-激酶活性，见图4。

图4 Res抗衰老潜在靶点的GO富集分析

2.6 KEGG通路分析

KEGG通路分析中前5条包含有：Ras、PI3KAkt、ErbB、Rap1、FoxO、GnRH、HIF-1信号通路，见图5和表2。在PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、HIF-1信号通路中都出现了 IGF1、MAPK1、EGFR，见表2。

表2 20条KEGG信号通路参数

图5 Res抗衰老潜在靶点KEGG通路分析

2.7 构建“药物-疾病-靶点-GO-KEGG通路”网络

将Res抗衰老的潜在治疗靶点，取前20条KEGG通路分析，把前10条GO（BP，CC，MF）富集分析结果导入Cytoscape3.8.0软件中构建“药物-疾病-靶点-GO-KEGG通路”网络。在“药物-疾病-靶点-GO-KEGG 通路”网络图中 EGFR、MAPK1和FGFR1处于核心位置，见图6。这说明白藜芦醇通过EGFR、MAPK1和FGFR1调节多条通路共同治疗衰老。

图6 “药物-疾病-靶点-GO-KEGG通路”网络图

3 讨论

细胞衰老能持续的对抗增殖反应，产生不经历细胞死亡的不可逆生长停滞状态[16-17]，在驱动机体衰老过程中起关键作用[18]。根据激活信号的不同，可分为复制性衰老和过早衰老。复制性衰老其特征是有限的潜能复制，将其寿命限制在一定数量的细胞分裂中。目前已知这个过程是通过细胞端粒（染色体末端的TTAGGG重复序列）[19-20]缩短触发信号诱导的[21]。另一方面，过早衰老是通过激活致癌基因、抑制基因失活、DNA损伤

和氧化应激等生物学作用实现的。Res有多种抗衰老作用，例如延缓血管衰老[22-23]以及剂量依赖性延缓细胞衰老[24]。Res在正常细胞和癌细胞中的作用是双向的，低剂量的Res可以通过诱导早衰来阻止癌细胞的生长；然而，Res也能诱导正常原代细胞衰老。

为了寻找Res抗衰老的关键靶点，本文利用PharmMapper数据库获取 Res作用靶点，用GeneCard数据库获取疾病相关靶点，用Venny图获取Res抗衰老靶点。

在PPI网络中，靶点互相关联节点数最高的前5名是IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR。此外，Res抗衰老潜在靶点的蛋白互相作用图还提示 IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR 与 SIRT1相互联系。SIRT1是重要的转录调节因子，下游众多因子已被发现对哺乳动物衰老有明显的抑制作用[25-26]，一方面参与调控NF-κB、FOXO、p53等，另一方面参与细胞葡萄糖稳态的保护，有利于延长生物体寿命，防止衰老。在氧化应激诱导的细胞衰老模型中，Res能增加Sirtuins活性，抑制过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）诱导人原代角质形成细胞衰老[27]。

FOXO3可影响细胞凋亡、细胞增殖等生物过程，其受Akt1，MAPK1等因子调节，在人类角质形成细胞中表达较高[28]。胰岛素的敏感性和细胞内信号传导受 AMPK-FOXO3的调控。Res通过 FOXO3参与许多细胞的基本过程，包括细胞应激的抵抗、胰岛素信号的传递和寿命等。敲除FOXO3后，Res不影响细胞衰老和增殖。因此，Res对角质形成细胞衰老和增殖的影响是由AMPK-FOXO3信号途径调控的。

本研究基于网络药理学方法对Res对抗衰老的潜在靶点进行分析。在蛋白相互作用（PPI）网络中MAPK1、IGFR和EGFR处于蛋白相互联系的核心位置，与其他靶点关联度高；GO富集分析和KEGG通路分析提示EGFR、MAPK1和IGFR与信号通路PI3K-Akt、FoxO和HIF-1存在联系；在药物-疾病-靶点- GO-KEGG通路网络图中MAPK1、IGFR、EGFR是相关度最好的靶点，说明他们可能是核心靶点。因此，Res主要通过MAPK1、IGFR和EGFR调节胰岛素、sirtuin和SIRT1等因子，进而影响FoxO、PI3K-Akt和HIF-1信号通路，调控衰老，这些结果为Res抗衰老的发病机制提供了新的研究思路。