肿瘤蛋白53靶基因1靶向微小RNA-33a对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

李小萌，乔潜林

胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤，约占脑 肿瘤的40%～60%［1］。胶质瘤细胞增殖较快、侵袭性较强，虽然神经肿瘤学已取得了长足的进展，但胶质瘤病人预后较差、死亡率仍然居高不下［2-3］。深入探索胶质瘤发生分子机制，寻找可靠诊断和治疗靶点是当前亟待解决的重要问题。长链非编码RNA（lncRNAs）是蛋白编码功能缺失但长度超过200个核苷酸的RNA，随着对lncRNAs和肿瘤相关性研究的不断深入，lncRNA在肿瘤发生发展中的作用被不断揭示［4］。近年来研究显示，在非小细胞肺癌中肿瘤蛋白53靶基因1（tumor protein 53 target gene 1，TP53TG1）表达下调，过表达TP53TG1可增强非小细胞肺癌细胞顺铂敏感性、促进细胞凋亡［5］；在胰腺癌中，TP53TG1表达上调，下调TP53TG1抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡［6］。在人神经胶质瘤细胞中，TP53TG1表达下调［7］，但TP53TG1对胶质瘤生物行为的影响及其机制尚未完全阐明。因此，本研究从2019年1—6月开展体外实验，通过观察TP53TG1对胶质瘤细胞恶性行为的影响，初步探索其分子机制，以期为基于TP53TG1防治胶质瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人正常神经胶质细胞HA和神经胶质瘤细胞U251购于上海斯信生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购于Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于Promega公司；MTT细胞增殖检测试剂盒、Annexin V-FITC∕PI试剂盒、TRIzol购于北京索莱宝生物科技有限公司；Western blotting相关试剂购于生工生物工程有限公司；pcDNA3.1、pcDNA3.1-TP53TG1、TP53TG1的小干扰RNA（si-TP53TG1）、TP53TG1野生型荧光素酶报告质粒（WT-TP53TG1）、miRNA模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-33a模 拟 物（mimics）、si-NC和TP53TG1突变型荧光素酶报告质粒（MUTTP53TG1）的构建和测序以及PCR引物均由上海英骏生物公司提供；兔源细胞周期蛋白D1（CyclinD1）抗体、兔源细胞周期蛋白激酶抑制剂（P21）抗体、兔源B细胞淋巴瘤（Bcl-2）抗体、兔源Bcl相关x蛋白（Bax）多抗体、兔源基质金属蛋白酶（MMP-2）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）羊抗鼠及羊抗兔抗体购于Abcam公司；鼠源E钙黏蛋白（E-cadherin）抗体购于Santa Cruz公司；Transwell小室和Matrigel基质胶购于Corning公司。

1.2 细胞培养、转染和实验分组HA和U251细胞均采用DMEM培养基（胎牛血清含量为10%）在37℃、含5%二氧化碳、培养箱孵育。将对数期U251细 胞 以2×105个∕孔 接 种6孔 板，利 用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1、pcDNA3.1-TP53TG1分别转染至汇合度为60%的U251细胞，依次标记为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-TP53TG1组，培养24～72 h后，进行后续实验分析。

为验证TP53TG1是通过调控miR-33a表达进而影响胶质瘤细胞生物学行为，把miR-33a mimics分别与pcDNA3.1或pcDNA3.1-TP53TG1共转染至U251细胞，依次标记为pcDNA3.1-TP53TG1+miRNC组和pcDNA3.1-TP53TG1+miR-33a组，检测U251细胞的增殖、迁移侵袭以及凋亡情况。

1.3 qRT-PCR检测用TRIzol试剂分离总RNA。首先合成cDNA模板，再按照说明书进行qPCR扩增。采用2-ΔΔCt法计算TP53TG1相对表达量（GAPDH为内参）。

1.4 双荧光素酶报告基因检测利用生物信息学软件在线预测TP53TG1靶基因发现，TP53TG1与miR-33a存在连续结合位点。构建野生型WT-TP53TG1和突变型MUT-TP53TG1荧光素酶报告载体，将miR-33a mimics和miR-NC分别与WT-TP53TG1或MUT-TP53TG1同时转染至U251细胞，测定培养48 h后各组细胞的荧光素酶活性。

1.5 MTT法检测细胞活力取对数期U251细胞按照2×103个∕孔接种于96孔板，按照1.2进行相应处理后，每培养24 h取出一组平板，每孔加入MTT试剂20 μL，孵育4 h后，弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，再孵育2 h溶解结晶，酶标仪测定490 nm处各孔的OD值。

1.6 Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力侵袭实验：经胰酶消化转染48 h的细胞，用不含血清的DMEM培养基重悬，调整细胞浓度约为1×106∕mL。向包被Matrigel基质胶的Transwell上室、24孔板下室分别加入200 μL细胞悬液、500 μL完全培养基，培养24 h，用甲醇固定Transwell膜下表面30 min，0.5%结晶紫溶液染色10 min。自来水冲洗去除多余染液，在倒置显微镜下随机选取5个视野拍照、计数，取均值表示细胞侵袭数。迁移实验时不用Matrigel基质胶包被Transwell小室，其余步骤同上。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡加入适量的1×Binding Buffer悬浮转染48 h细胞使其浓度达到1×106个∕mL。向流式管内加入100 μL悬液，然后依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL的PI，室温避光孵育15 min，加入PBS液至500 μL，混合均匀后于1 h之内用流式细胞仪评估细胞凋亡。

1.8 Western blotting检测RIPA裂解法提取总蛋白，取适量蛋白煮沸3 min使其变性。每组用30 μg蛋白进行SDS-PAGE，湿法将蛋白转移至PVDF膜。Western封闭液阻断膜，洗膜后，分别加入已稀释的抗Cyclin D1（1∶500）、P21（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）、MMP-2（1∶500）、E-cadherin（1∶500）和GAPDH（1∶2 500）的Ⅰ抗4℃孵育过夜。再次洗膜后，加入Ⅱ抗稀释液室温孵育1 h，化学发光显色后拍照，成像扫描分析系统测定目的条带相对于GAPDH的灰度值。

1.9 统计学方法用SPSS 20.0进行统计分析，本研究中所有计量资料均采用±s表示，两组间比较时采用t检验，多组间比较时采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞HA和U251中TP53TG1的表达情况与人正常神经胶质细胞HA相比，神经胶质瘤细胞U251中TP53TG1的表达显著降低，（1.03±0.10）比（0.28±0.03），差异有统计学意义（t=21.551，P＜0.001）。

2.2 过表达TP53TG1对细胞U251增殖、凋亡的影响与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-TP53TG1组TP53TG1的表达显著升高，P21和Bax蛋白的表达显著升高，Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表达显著降低，细胞活力显著降低，凋亡率显著升高（P＜0.001）。表明，过表达TP53TG1可抑制U251细胞增殖，促进细胞凋亡。见图1，表1。

图1 过表达肿瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）对细胞U251增殖、凋亡的影响

表1 过表达TP53TG1对细胞U251增殖的影响∕±s

表1 过表达TP53TG1对细胞U251增殖的影响∕±s

注：TP53TG1为肿瘤蛋白53靶基因1，pcDNA3.1为空载体质粒，pcDNA3.1-TP53TG1为TP53TG1的过表达质粒。

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2.3 过表达TP53TG1对细胞U251迁移、侵袭的影响与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-TP53TG1组U251细胞迁移和侵袭数减少［（138±14.01）个 比（72±7.26个）、（126±12.54）个 比（65±6.63）个，t=12.548、12.901，均P＜0.001］，MMP-2蛋白水平降低［（0.63±0.06）比（0.21±0.02），t=19.922，P＜0.001］，Ecadherin蛋白水平升高［（0.33±0.03）比（1.02±0.10），t=19.827，P＜0.001］，过表达TP53TG1可抑制U251细胞迁移和侵袭。见图2。

图2 过表达TP53TG1对细胞U251 E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响

2.4 TP53TG1靶向调控miR-33a表达生物信息学软件在线预测到TP53TG1和miR-33a存在结合位点，见图3。与miR-NC、WT-TP53TG1共转染组相比，miR-33a、WT-TP53TG1共转染组U251细胞的荧光素酶活性显著降低［（1.04±0.10）比（0.32±0.03），t=20.689，P＜0.001］；与miR-NC、MUT-TP53TG1共转染组相比，miR-33a、MUT-TP53TG1共转染组U251细胞的荧光素酶活性无显著变化［（1.02±0.10）比（1.06±0.10），t=0.849，P=0.409］。与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-TP53TG1组U251细 胞miR-33a的 表达水平显著降低，（1.03±0.10）比（0.43±0.04），t=16.713，P＜0.05；与si-NC组 比 较，si-TP53TG1组U251细胞miR-33a的表达水平显著升高，（1.04±0.10）比（1.76±0.18），t=10.490，P＜0.001。以上结果表明，TP53TG1靶向负调控miR-33a表达。

图3 肿瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）靶向miR-33a

2.5 过表达miR-33a能逆转TP53TG1对细胞U251增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-TP53TG1组U251细胞活力、miR-33a表达以及Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白水平降低，凋亡率以及P21、Bax和E-cadherin蛋白水平升高，迁移数和侵袭数减少；与pcDNA3.1-TP53TG1+miR-NC组 比 较，pcDNA3.1-TP53TG1+miR-33a组U251细胞细胞活力、miR-33a表达以及Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白水平升高，凋亡率以及P21、Bax和E-cadherin蛋白水平降低，迁移数和侵袭数增多（P＜0.001）。以上结果表明，过表达miR-33a能够逆转TP53TG1对细胞U251增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。见图4，表2。

表2 过表达miR-33a能逆转肿瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）对细胞U251细胞活性的影响∕±s

表2 过表达miR-33a能逆转肿瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）对细胞U251细胞活性的影响∕±s

注：①与pcDNA3.1组比较，P＜0.05。②与pcDNA3.1-TP53TG1+miR-NC组比较，P＜0.05。

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图4 过表达miR-33a能逆转TP53TG1对细胞U251凋亡及Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响：A为过表达miR-33a能逆转TP53TG1对细胞U251凋亡的影响；B为过表达miR-33aCyclin D1、P21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2蛋白的表达

3 讨论

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤［8］。尽管有手术和放化疗等治疗手段，胶质瘤的发病率和死亡率仍然很高［1］。阐明胶质瘤的发生发展的分子机制，开发更有效的诊治疗方法，对改善胶质瘤病人预后，提高生存率具有重大意义。

lncRNA是活跃的生物分子，在许多肿瘤中发挥重要的调控作用。多项研究表明，lncRNA参与调控神经胶质瘤的生长、转移和耐药等多种生物学过程的调控［9-11］。TP53TG1是p53诱导的lncRNA，在人类癌症的进展中起着至关重要的作用。本研究探索了TP53TG1在胶质瘤进展中的作用，结果显示胶质瘤细胞中TP53TG1表达下调，这与包雯等［12］的研究结论相吻合，可能与TP53TG1启动子CpG岛高甲基化有关，TP53TG1表达的恢复与结肠直肠癌和胃癌细胞的侵袭和迁移能力降低相关［13］。Cyclin D1是重要的细胞周期蛋白，主要通过促进细胞从G1期进入S期发挥细胞增殖正性调控作用，而P21则发挥相反的作用［14］。Bcl-2家族在细胞凋亡中具有重要作用，促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的比例是细胞凋亡发生的关键［15］。E-cadherin是上皮细胞标志物，肿瘤细胞中E-cadherin表达下调，而MMP-2表达上调则通过降解细胞外基质促进肿瘤的侵袭和转移［16］。本研究发现过表达TP53TG1在抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭诱导凋亡，伴随着P21、E-cadherin和Bax蛋白水平的增加以及Cyclin D1、MMP-2和Bcl-2蛋白水平的下降。提示TP53TG1在胶质瘤中发挥抑癌基因作用。

近年来，lncRNA通过与miRNA相互作用调控肿瘤发生发展的机制被广泛报道。为揭示TP53TG1调控胶质瘤发生发展的分子机制，利用生物信息学软件进行靶基因预测发现，miR-33a是TP53TG1的潜在靶基因。随后的双荧光素酶报告基因实验证实了TP53TG1和miR-33a的靶向关系，并通过Western blotting证实在胶质瘤中miR-33a的表达到受到TP53TG1的负性调控。miR-33a是一种内含子miRNA，位于固醇反应原件结合蛋白基因SREBF2的内含子序列中，在调节胆固醇和脂肪酸代谢中发挥重要作用［17］。研究显示，miR-33a在胶质瘤组织和细胞中表达上调，高表达miR-33a的胶质瘤病人肿瘤体积较大、生存率较低，敲除miR-33a可抑制胶质瘤的生长［18］。此外，miR-33a高表达还可促进胶质瘤细胞的自我更新［19-20］。于是，本研究推测TP53TG1通过负性调控miR-33a表达抑制胶质瘤的发生发展。为证实TP53TG1的抗胶质瘤作用依赖于miR-33a表达下调，本研究将pcDNA3.1-TP53TG1和miR-33a mimics共转染胶质瘤细胞进行恢复实验，结果显示过表达miR-33a可显著逆转TP53TG1对胶质瘤细胞活力、迁移数、侵袭数、凋亡率以及对应蛋白水平的影响。

综上所述，TP53TG1在胶质瘤细胞中表达下调，上调TP53TG1通过靶向miR-33a抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，TP53TG1有望成为胶质瘤的潜在诊疗靶点。