基于网络药理学研究半夏治疗功能性消化不良的作用机制

蒙毅，吴月霞，龚纯，周瑞东，徐杉，朱永苹

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是指具有餐后饱胀不适、早饱感、上腹痛、上腹烧灼感等中的一项或多项的症状，而不能用器质性、系统性或代谢性疾病等来解释产生症状原因的疾病。罗马Ⅳ诊断标准将FD分为餐后不适综合征（PDS）和上腹痛综合征（EPS）两个亚型［1］。FD发病机制还没有完全明确，业界普遍认为与胃肠动力障碍、胃酸分泌异常、内脏高敏感性、胃肠道激素、幽门螺杆菌感染、精神心理、基因等因素相关［2］。西医治疗需长时间持续用药，而且会出现比较明显的副反应，从而造成病人经济负担和生活质量下降［3］。FD根据其症状归属，以餐后饱胀不适、早饱为主症者，应属于中医学“痞满”“积滞”的范畴；以上腹痛、上腹烧灼感为主症者，应属于中医学“胃痛”范畴。中医对于本病的治疗近年来也取得了不错的疗效［4］。

半夏来源于天南星科植物半夏的干燥块茎，始载于《神农本草经》，列为下品。半夏性温味辛、有毒，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效［5］。半夏常在临证处方中大量运用，对治疗脾胃不和、心下痞证、中焦不畅等具有良好地临证效果。

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统进行网络分析，从整体水平观察“药物-靶点-疾病”的复杂网络关系，强调对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，进而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用［6］。本研究采取网络药理学的研究方法，筛选半夏的活性成分和作用靶点，分析其生物功能及信号通路，与FD的治疗靶点进行映射，探究半夏治疗FD的作用机制，为临床推广半夏的使用提供科学依据。

1 资料和方法

1.1 半夏活性成分的筛选本研究于2020年1—2月借助中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（网址为：http：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php），将半夏作为关键词输入数据库检索，同时满足口服生物利用度（oral bioavailability，OB）值≥30%和生物活性分子类药性（drug-likeness，DL）值≥0.18这两个条件，得到半夏的活性成分。

1.2 半夏活性成分的作用靶点的选取通过TCMSP数据库选取半夏活性成分的作用靶点（targets），利用UniProt、HCBI和PubMed等数据库，得到药物活性成分靶点对应的基因名（official gene symbol）。

1.3 FD的靶点筛选借助GeneCards（https：∕∕www.genecards.org∕）、OMIM（https：∕∕omim.org∕）数据库，将functional dyspepsia作为关键词检索，得到FD的相关治疗靶点。

1.4 半夏与FD的交集靶点筛选借助Venny 2.1（https：∕∕bioinfogp.cnb.csic.es∕tools∕venny∕），将半夏活性成分的靶点基因与FD的靶点基因取交集，从而得到交集靶点，并绘制相关的韦恩图。得到的交集靶点将会是半夏治疗FD的核心靶点。

1.5 中药调控网络可视化图的绘制利用Cytoscape 3.7.2软件构建药物-活性成分-疾病-治疗靶点四维中药调控网络可视化图，通过网络图的角度研究半夏治疗FD的作用机制。

1.6 FD的蛋白互作网络的构建将得到交集靶点在STRING 11.0（https：∕∕string-db.org∕）数据库检索，进行蛋白质-蛋白质的相互作用分析，得到PPI网络图。同时将PPI网络以TSV的格式导入“R”软件（The R Project for Statistical Computing，https：∕∕www.r-project.org∕）进行可视化。

1.7 GO功能富集分析通过KOBAS 3.0平台（http：∕∕kobas.cbi．pku．Edu.cn∕index．php），将半夏活性成分与FD的交集靶点基因进行GO富集分析，运用Omishare Tools（网址为http：∕∕www.omicshare.com∕tools∕index.php∕）可视化其分析结果，从而了解半夏治疗FD核心靶点基因本体的作用功效。

1.8 KEGG通路富集分析采用DAVID 6.8数据库（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https：∕∕david.ncifcrf.gov∕），将交集靶点基因名称输入数据库检索和转化操作，以P＜0.05对半夏治疗FD的核心靶点基因进行KEGG通路富集分析，运用Omicshare可视化分析KEGG通路，分析半夏治疗FD相关重要的信号通路。

2 结果

2.1 半夏活性成分及其活性成分靶点的筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP，同时满足OB＞30%和DL＞0.18两个条件检索半夏，得到13个半夏活性成分（见表1）。将此13个半夏的活性成分继续在TCMSP数据库搜索得到173个活性成分靶点。借助UniProt、HCBI和PubMed等数据库，得到药物活性成分靶点对应的基因名74个。

表1 半夏的活性成分

2.2 半夏治疗FD的作用靶点分析借助Gene-Cards（https：∕∕www.genecards.org∕）、OMIM（https：∕∕omim.org∕）数据库，将functional dyspepsia作为关键词检索，得到FD的相关治疗靶点基因1 627个。将74个半夏活性成分靶点基因与1 627个FD的靶点通过Venny 2.1取交集，得到35个交集靶点，这35个交集靶点将会是半夏治疗FD的核心基因。交集靶点基因主要包括RACα丝氨酸∕苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、B淋巴细胞瘤-2基因（BCL2）半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）、半胱氨酸蛋白酶-9（CASP9）、凋亡调节因子（BAX）、α-2C肾上腺素能受体（ADRA2C）、α-2A肾上腺素能受体（ADRA2A）、孕酮受体（PGR）、维甲酸受体RXRα（RXRA）等。

2.3 半夏治疗FD的靶点PPI网络分析将半夏与

FD的交集靶点通过STRING 11.0数据库进行检索，蛋白质种类选择“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“medium confidence”，设置隐藏未连接的蛋白节点，进行交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建，该PPI网络有35个节点，195条边，平均节点degree值为11.1。同时将PPI网络以TSV的格式导入“R”软件（The R Project for Statistical Computing，https：∕∕www.r-project.org∕）进行可视化图，处于该PPI网络中心靶点蛋白质有AKT1、BCL2、CASP3、CASP9等，这可能是半夏治疗FD的重要靶点蛋白。

2.4 半夏治疗FD靶点GO功能富集分析通过KOBAS 3.0平台，将半夏活性成分与FD的35个交集靶点基因以P＜0.05进行GO富集分析，同时运用在线绘图Omishare Tools可视化其分析结果，了解半夏治疗FD的核心靶点基因本体的作用。结果显示35个交集靶点基因涉及66个GO条目，依据P-adjust大小进行排序，得到前20个GO条目。通过GO分析发现半夏治疗FD主要通过儿茶酚胺结合、内肽酶活性、核受体活性、转录因子活性、凋亡过程中的半胱氨酸型内肽酶活性等功能。

2.5 半夏治疗FD靶点KEGG信号通路富集分析采用DAVID 6.8数据库，将35个交集靶点基因名称输入数据库检索和转化操作，以P＜0.05对半夏治疗FD的核心靶点基因进行KEGG通路富集分析，运用Omicshare可视化分析KEGG通路，分析半夏治疗FD相关重要的信号通路。结果显示35个交集靶点基因涉及97条信号通路，依据P-adjust大小进行排序，得到前20条半夏治疗FD的主要信号通路。通过KEGG分析发现，半夏治疗FD主要与凋亡-多物种（apoptosis-multiple species）、凋亡、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人类免疫缺陷病毒1型感染、大肠癌、肿瘤坏死因子等信号通路有关。

3 讨论

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点（Nodes）进行多靶点药物分子设计的新学科。中医的整体观和辨证论治是将人类看作一个互相联系的复杂网络系统，中药在该网络系统中具有极其复杂的物质体系，其有效成分和作用靶点同样是一个复杂的网络关系。网络药理学与中医整体观相互结合，从整体水平揭示“药物-靶点-疾病”的复杂网络关系，更好阐释了中药多成分、多靶点、多通路的作用特点。通过网络药理学得到的结论，今后进行相关的实验研究对其验证，为中药现代化的研究提供重要的指导方向，有利于提高药物的治疗效果，降低毒副作用，为药物推广至临床使用提供重要科学的依据［7］。

通过上述的研究结果，通过筛选得到了13个药物的活性成分、35个核心靶点基因、20个GO条目和20条KEGG通路。我们将这35个核心靶点基因通过STRING 11.0数据库进行PPI网络分析，发现这些蛋白质之间存在着复杂的关系，而不是单线作用，从而可以推断靶点蛋白之间的相互作用调节可能是半夏治疗FD的潜在机制之一。同时我们对35个半夏治疗FD的核心靶点进行KEGG信号通路分析，以P＜0.05为条件，按照P-adjust大小进行排序，得到前20条半夏治疗FD的主要信号通路，主要包括凋亡-多物种、凋亡、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类免疫缺陷病毒1型感染、大肠癌、肿瘤坏死因子等信号通路有关。

FD的发病机制业界普遍认为由多种病理生理学机制参与。胃肠动力障碍和胃肠道激素属于引发FD的重要发病机制［8］。形成胃肠动力障碍的原因主要与器官间功能的紊乱，胃肠平滑肌收缩功能失调，多种细胞的信号通路传导障碍以及相关基因、蛋白表达的不足等，然而这些因素可能会诱导细胞凋亡。

细胞凋亡通常是指机体细胞在生长发育过程中或者在一定条件下，通过细胞内外因素调控下而发生的一种程序性死亡。细胞凋亡受到多种相关基因的调控，例如Bcl-2、Caspase、Bax等基因。Caspase调控细胞凋亡是指杀死细胞一般通过裂解核酸酶抑制蛋白激活核酸酶活性进行水解核酸和破坏细胞结构的完整性的两种途径实现的［9］。Caspase家族对于细胞凋亡过程中起到了至关重要的作用，其可发生在细胞凋亡的各个时期，凋亡的过程开始于激活的Caspase酶，通过线粒体、内质网、死亡受体这三个通路实现。Caspase-3在细胞凋亡的过程中处于核心的地位，是整个通路的关键因子。Caspase处于非活化的酶原状态，不能具有生理活性，只有被激活的Caspase-3才能具有生理活性，引发细胞凋亡级联反应［10］。在线粒体通路中，线粒体内的细胞色素C释放入胞浆后，细胞色素C与Caspase-9形成凋亡复合物，同时作用于下游的Caspase-3，使得Caspase-3被激活，从而引发细胞凋亡级联反应［11］。同时在细胞凋亡的研究中Bcl-2是最重要的基因之一，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白因子，能够对多种组织的细胞凋亡起到抑制作用，增加细胞存活的时间［12］。有研究发现，Bcl-2在与Caspase的共同通路中处于Caspase-3上游，Bcl-2可以改变线粒体膜的通透性，抑制线粒体途径中的细胞色素C的释放，进而抑制Caspase-3的活性，最后抑制了细胞的凋亡。

因此Bcl-2与Caspase-3呈负相关的关系。而Bax表达增强则促进细胞凋亡的发生［13］。

我们从半夏治疗FD的KEGG富集分析得到的Apoptosis-multiple species、Apoptosis、Hepatitis B、Colorectal cancer、p53 signaling pathway、TNF signaling pathway等信号通路，这些通路均与Bcl-2、Caspase、Bax等凋亡因子相关，参与到细胞凋亡的相关机制中。接下来我们主要分析Apoptosis-multiple species信号通路，有研究表明［14］，当胃内组织发生细胞凋亡时，促进了Bax mRNA表达，使Bcl-2mRNA的表达降低，从而造成Caspase被活化。因此在该通路提高Bcl-2的表达，进而抑制Bax、Caspase-9和通路下游Caspase-3的表达，最终抑制细胞发生凋亡，将可能是半夏治疗FD的重要机制之一。

以上分析可以推断出FD可能与胃肠内组织发生细胞凋亡有关，受到细胞凋亡相关基因的影响。因此，通过抑制细胞凋亡，从而促进胃肠动力的恢复，可以有效地治疗FD，可能是半夏治疗FD的重要的生物学机制之一。

半夏具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效，半夏在《中药学》《中华本草》和《中药大辞典》等权威著作中规定的用量5～10 g。但在中医经典《伤寒论》和《金匮要略》中半夏均大剂量使用，按现代剂量换算约为10～30 g。蔡秋杰、曹洪欣［15］通过对仲景运用半夏的经验学习中得出，发现仲景偏于重用生半夏，生半夏作为散剂服用是有毒性的，能让人口舌麻木肿痛，但生半夏经过常规的汤剂久煎后是安全无毒的，同时也能增强半夏之功效。近些年来不少医家也在研究中证实［16-17］，张仲景在《伤寒论》和《金匮要略》使用半夏频率极高，而且是大剂量使用，但效果显著。由此可以证实半夏在经典经方的地位极其重要，在半夏泻心汤、半夏厚朴汤、小半夏汤、黄芩加半夏生姜汤、瓜蒌薤白半夏汤等健脾益胃、消痞散结方剂中，半夏的计量均大于其他药物的剂量，处于君药的地位。因此半夏对于治疗“胃痛”“痞满”等中焦疾病尤为重要。

刘余等［18］研究表明，半夏泻心汤能够增加Bcl-2mRNA表达，从而抑制其下游因子Caspase-3的表达，最终抑制胃内组织的细胞凋亡。晋红宾等［19］的动物实验研究中发现，瓜蒌薤白半夏汤能够促进抗凋亡因子Bcl-2的表达，同时减少Bax蛋白的表达，达到了对心肌细胞凋亡的抑制作用。从上述讨论中我们知道半夏在这些方剂中均处于君药的地位，从而我们可以推断出半夏能够在细胞凋亡通路中增强Bcl-2的表达，同时抑制了Bax和Caspase-3的表达，这与我们半夏治疗FD的KEGG分析得到的通路中相关的细胞凋亡机制相符，最终抑制了细胞的凋亡，促进了胃肠动力的恢复，有效地治疗了FD，但是其具体凋亡通路的机制和改善以及后续的影响仍有待我们做进一步的实验研究。

综上所述，本研究基于网络药理学平台，探讨了半夏治疗FD的多成分、多靶点、多途径的分析，具体从半夏的有效成分、靶点以及与FD相关靶点和交互蛋白进行分析，同时也对半夏治疗FD的核心靶点进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。通过分析我们可以初步地知道半夏治疗FD相关靶点所发挥的作用。上述分析得到的结果与已发表的文献基本符合，富集得到的多条通路均与细胞凋亡因子相关，为半夏对治疗FD的作用机制提供了科学依据。但是，细胞凋亡通路的具体的机制和后续的改善作用仍需要做相关的实验去研究证实。在PPI网络中的中心蛋白、GO功能分析以及KEGG通路分析未讨论的靶点，可能会成为今后研究半夏治疗FD的作用机制提供线索。然而我们仅仅利用网络药理学平台半夏的有效成分及作用靶点，可能存在原始数据不一致的因素，以及数据库的信息更偏向于某些热点领域，难免会遗漏有研究价值的重要信息，因此利用网络药理学对半夏全部成分的研究存在着困难，需要我们未来借助其他的信息技术以及实验研究来验证本次探究的成果。