间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎的研究进展

刘文彬

软骨组织是一种具有弹性的结缔组织，由透明质酸、胶原纤维、蛋白多糖和软骨细胞组成。软骨组织无血管及神经结构。这些结构特征往往限制了软骨中氧气和营养物质的充足供应，从而限制了受损软骨组织的有效再生[1-2]。因此软骨组织在创伤、持续负重后易发生骨性关节炎（osteoarthritis, OA）[3-4]。目前，OA的发病机制尚不明确。因此，针对OA的治疗尚无有效的治疗手段。目前，OA的治疗方法主要包括：关节镜清理术、截骨畸形矫正术、单髁表面置换术和全膝关节表面置换术。这些手段往往存在外源植入物感染、植入物或组织替代物寿命短、需要二次手术、新形成组织与天然软骨界面不一致等缺点[5]。要克服这些限制，最近有研究通过使用间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）或软骨细胞移植到受损的软骨部位可以达到修复软骨缺损的效果[6]。MSC可以从不同的组织如外周血、骨髓、脂肪中提取到，具有低成本、易获得、免疫抑制能力低等优点[7-8]。然而，骨髓间充质干细胞移植在制备细胞来源方面也存在以下技术缺陷：1）供体部位的并发症不容忽视；2）细胞扩张需要一定的时间；3）培养细胞时会存在去分化不良；4）供体年龄较大时，获得的细胞的内在活性和功能降低；5）大规模细胞生产的质量控制不一致。

最新研究利用来自MSC的外泌体以取代传统的细胞为基础的OA治疗可以避免MSC移植的缺点。外泌体是直径为30～150 nm的细胞囊泡，外泌体作为生物信号系统，其携带的蛋白质、脂质、DNA和RNA参与细胞间的多种生物学过程[9]。特别是MSC来源的外泌体不仅具有免疫调节和组织再生能力，而且还表现出一定的免疫治疗优势[10]。此外，MSC来源的外泌体可避免肺栓塞等相关并发症[11]。同时，MSC的细胞治疗有可能在分化过程中形成肿瘤，但是MSC来源的外泌体本身不具有代谢功能，因此不具有致瘤性。基于MSC来源的外泌体的特点，近年来，一系列研究探讨了MSC来源的外泌体对皮肤[12]、心脏[13]、骨[14]和软骨等[15]组织再生的疗效。特别是外源性MSC来源外泌体可作为增强软骨组织再生，有效治疗软骨组织缺损。本文就以下3个方面进行综述：1）利用MSC来源的外泌体治疗OA的研究进展；2）外泌体中miRNA的研究进展；3）外泌体组织工程支架的设计和应用。

1 MSC来源的外泌体治疗OA

最近的研究表明，移植MSC后产生的各种旁分泌信号可诱导软骨组织再生。在这一组织愈合过程中，外泌体是细胞间通信的重要介质。MSC来源的外泌体的治疗功能之一是抗炎。在OA发生过程中，促炎介质分泌水平升高，细胞外基质降解以及软骨细胞凋亡。由于炎症与OA的进展密切相关，MSC来源的外泌体的抗炎作用可用于OA的治疗。脂肪来源MSC可以通过抗炎作用发挥软骨保护作用。脂肪来源MSC的外泌体可减少OA软骨细胞中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10等炎性因子的产生。此外，环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）[16]和前列腺素E1（prostaglandin E1，PGE1）的表达水平下调，最终导致前列腺素 E2（prostaglandin E2， PGE2）的产生减少[17]。此外，脂肪来源MSC的外泌体可以抑制软骨细胞核因子（NF）-κB信号通路的激活，因此发挥抗炎作用。研究表明，BMSC来源的细胞外囊泡（BMSC-EV）可以抑制炎症介质对软骨稳态的细胞的破坏，也可以抑制TNF-α诱导的OA患者软骨细胞的炎症作用。BMSC-EV处理后可以明显降低COX-2和IL-1、IL-6、IL-8和IL-1这些炎症介质的表达。相反，MSC来源外泌体可降低胶原酶活性，促进软骨细胞增殖和糖胺聚糖沉积。Cosenza等[18]研究了MSC来源外泌体对OA小鼠软骨降解的保护作用。结果提示，MSC来源外泌体可以通过逆转IL-1β处理软骨细胞后的软骨基质降解。

MSC来源外泌体除了可以减轻软骨细胞炎症反应之外，同样可以调节软骨细胞凋亡和巨噬细胞活性。比如，Cosenza等[18]研究了MSC来源外泌体对OA大鼠软骨降解的保护作用。作者发现MSC来源外泌体可以明显降低IL-1β诱导的软骨细胞的凋亡。另外MSC来源外泌体可以降低F4/80巨噬细胞CD86、MHCII以及CD40的表达量。同样的，当MSC与巨噬细胞共培养时，能够减少M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化[19]。而且在胶原酶诱导的OA模型中，关节腔内注射MSC来源外泌体可以明显提高软骨的体积，软骨表面体积比以及厚度。Zhang等[20]从胚胎来源的间充质干细胞中获得外泌体，并利用此外泌体探讨了对关节炎软骨再生的影响。在这项研究中，关节腔内注射胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）来源外泌体用于治疗临界软骨缺损，发现在术后12周时，ESC来源外泌体可以明显促进II型胶原（collagen type II alpha 1，COL2A1）的表达。ESC来源外泌体对软骨修复的主要机制如下：1）促进软骨细胞增殖；2）降低软骨细胞凋亡；3）减少炎性细胞因子的水平；4）提高M2巨噬细胞浸润；5）调制免疫表型和反应[21]。此项研究还发现，ESC来源外泌体可增加AKT和ERK磷酸化进而介导软骨组织的修复和再生。此外，ESC来源外泌体还可用于颞下颌关节OA的治疗。本研究还表明，可以通过调节AKT、ERK和AMPK信号，通过减轻炎症和恢复软骨基质稳态来减轻颞下颌关节OA。

在动物实验中，当AMPK不足时，OA的发展加速[22]。ESC来源外泌体通过抑制了基质金属酶13 （matrix metallopeptidase，MMP13）和一氧化氮（nitric oxide，NO）的产生，并能防止颞下颌关节OA大鼠的细胞损伤、凋亡、线粒体功能障碍和基质降解。

2 使用MSC外泌体中包含的miRNA治疗OA

外泌体包含了蛋白质、脂质、DNA和RNA等多种物质。之前研究证明，外泌体中miR-92a-3p可以通过靶向WNT5A的表达，增强软骨形成并抑制软骨降解，而WNT5A在软骨形成的晚期可以激活MMPs，减少软骨ECM的降解[23]。在其他研究中也发现，miR-92a-3p同样可以增强软骨形成能力[24]。将miR-92a-3p注射到OA小鼠模型后，发现miR-92a-3p能抑制软骨的降解[25]。

miR-140-5p同样可以促进软骨组织再生，延缓OA的进展[26]。Tao等[27]将来源于人类滑膜间充质干细胞的外泌体和过表达miR-140-5p过表达的人类滑膜间充质干细胞的外泌体用于治疗大鼠OA。人滑膜间充质干细胞来源的外泌体能刺激软骨细胞的迁移和增殖。但是人滑膜间充质干细胞来源的外泌体抑制ECM的合成。为了克服人类滑膜间充质干细胞来源外泌体的这一缺陷，通过慢病毒转染使miR-140-5p在人类滑膜间充质干细胞中高表达，发挥miR-140-5p促ECM合成的作用可以有效避免人类滑膜间充质干细胞来源外泌体的缺陷。此外，外源性给予转化生长因子 -β（transforming growth factor，TGF-β）生长因子可刺激外泌体miRNA在间充质干细胞中的表达。已有研究表明，TGF-β可通过下调特异性蛋白1（special protein，SP1），增强MSC来源外泌体中miR-135b的表达，促进软骨细胞增殖。miR-135b可以通过与SP1的3’-UTR位点反应调节SP1的活性[28]。其他报道也发现SP1是miR-140维持软骨细胞增殖的靶点[29]。髌下脂肪垫间质干细胞的外泌体可通过抑制mTOR信号通路提高软骨细胞自噬水平[30-31]，缓解IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。

3 外泌体传递功能支架的开发

将外泌体用于软骨再生的过程中，只需将外泌体溶解至PBS或生理盐水中，然后将制备好的悬浮液局部注射到软骨缺损部位。但是注射外泌体在软骨缺损的局部保留是困难的，注射后会发生弥散。为了更好维持外泌体在缺损局部的浓度，组织工程技术如水凝胶和支架可以有效地解决外泌体应用的不足。组织工程技术可增加外泌体在局部缺陷部位的存留时间，并可持续促进软骨缺损的修复。既往研究提示原位水凝胶胶可以用于外源性外泌体的靶向传递。这种水凝胶胶的优点是：1）软骨缺损修复的原位凝胶可以提供形态缺陷特异性；2）有效保留外泌体的各项生物学特征；3）水凝胶材料与天然软骨组织的结合紧密；4）水凝胶内的信号分子可以进行动态交换[32]。亚胺介导的邻硝基苄醇基（HA-NB）光交联透明质酸水凝胶可以实现原位凝胶化[33-34]。作为一种有效的外泌体储液体，初始加入的外泌体在HA-NB水凝胶中可以保留14 d，外泌体的释放率约为每天1×1010/mL[35]。释放的外泌体可以内化并协同包裹凝胶中的软骨细胞和MSC。为了评价外泌体复合HA-NB水凝胶的体内修复效果，将含有1×1011/mL外泌体的原位形成凝胶填充在兔膝关节股骨髁中全层骨软骨缺损（直径4 mm，深度3 mm）中。组织学分析显示，外泌体复合HA-NB水凝胶改善了细胞向凝胶中的迁移，使新形成的软骨组织与已有的组织融合，有效诱导软骨再生。

有研究应用3D打印的甲基丙烯酸明胶/软骨ECM/外泌体支架同样可以达到良好的软骨缺损修复效果[36]。外泌体和ECM成分的结合协同增强了3D打印复合支架的成软骨能力。另外取向的支架通道及其可控结构可以促进支架内细胞生长以及营养物质。与未处理对照组和只使用凝胶组相比，包覆外泌体的生物支持除了结构上的优势外，还表现为体内M2巨噬细胞极化，线粒体功能障碍恢复以及软骨再生。

4 总结

近年来，MSC来源外泌体在科研领域已经受到广泛关注，由于其便于获取及操作，MSC来源外泌体在治疗应用中具有巨大的潜力。相比于MSC的全细胞疗法，MSC来源外泌体有良好的耐受性，并且免疫原性的不良反应风险更低，尽管已有研究证实MSC来源外泌体是安全有效的，但是MSC来源外泌体应用在临床治疗中还需要对其生物发生、药代动力学和生物分布机制等进一步深入探究。外泌体参与细胞之间的信息传递，对软骨细胞的凋亡、细胞外基质降解以及炎症反应等过程发挥重要作用。随着对MSC来源外泌体研究的深入，以及对外泌体提取、分离和药物装载方法的完善与提高，外泌体对软骨再生的靶向治疗，可能在未来OA治疗中发挥重要作用。