石菖蒲抗癫痫药效物质及其机制研究进展

赵颖 徐薇薇 王莹 张宓 刘金民

癫痫是中枢神经系统常见疾病，全球患病人数超过7000万人，我国约有1000万以上癫痫患者[1]。中药作用具有多成分、多效应、多环节、多靶点和毒副作用小的特点，目前已成为抗癫痫药物研究的热点领域。石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorustatarinowiischott的干燥根茎，味辛、苦，性温，具有开窍豁痰、醒神益志的功效，广泛应用于癫痫、健忘、失眠、抑郁、中风、精神障碍、耳鸣耳聋等病症[2-3]，是中药复方治疗癫痫疾病中使用频次最多的药物之一，《本草纲目》有“治中恶卒死，客忤癫痫”的记载。现代药理研究发现石菖蒲具有多种药理学活性，包括抗惊厥、镇静、抗抑郁、抗痴呆等[4]。本文对石菖蒲抗癫痫药效物质及其机制的研究进展进行归纳总结，为石菖蒲的进一步研究和抗痫新药研发提供参考。

1 石菖蒲抗癫痫作用的药效物质研究

1.1 石菖蒲中的活性物质

石菖蒲已被分离鉴定的单体化合物超过百余种，由于地域、生长习性或采集时间不同，其被鉴定的化学成分常呈现多样性。石菖蒲所含的化学成分主要包括挥发油类、黄酮类、醌类、生物碱类、三萜皂苷类、苯丙素类、有机酸类、氨基酸类及糖类等多种化合物。国外研究从石菖蒲提取物中鉴定出46种化合物，包括黄酮苷、酰胺、木脂素、苯丙素、苯丙烷衍生物及其他化合物，与参考标准比对后明确了14种成分，主要化学成分为倍半萜、苯丙烷、木脂素、生物碱和氨基酸类等，以α-细辛醚、β-细辛醚为主要活性成分[5-6]。还有研究通过分离和光谱鉴定，发现了异水菖蒲二醇、2-羟基菖蒲螺烯酮、2-乙酸菖蒲螺烯酮、4,10-香木兰烷二醇、菖蒲烯倍半萜品醇、菖蒲碱甲、4-(2-甲酰-5-甲氧基甲基吡咯基)丁酸甲酯，并发现两种具有显著抗氧化能力的新型生物碱[7]。

国内研究者对石菖蒲化学成分进行了研究，采用色谱技术从石菖蒲根茎的乙酸乙酯萃取物中分离出15个化合物，如α-细辛醚、β-细辛醚、水菖蒲酮、菖蒲螺烯酮、顺式-甲基异丁香酚、甲基丁香酚、细辛醛、细辛酮、γ-细辛醚、5-羟甲基糠醛、桉脂素等[8]，与前者不尽相同。还有研究通过对石菖蒲的根茎乙醇提取物进行分离纯化，并分离出新的化合物[9]。方永奇等[10]采用气相色谱-质谱法对石菖蒲挥发油灌胃给药后进入大鼠脑组织中的挥发油成分进行分析，结果显示能透过血脑屏障的成分有β-细辛醚、α-细辛醚、甲基丁香酚、顺式甲基异丁香酚、榄香素，主要为挥发油类物质，其中以α-细辛醚(0.035%～0.258%)和β-细辛醚(0.705%～1.53%)含量最多，揭示了石菖蒲对中枢神经系统作用的物质基础。

近年来石菖蒲化学成分研究已深入到许多方面，但仍然存在着较大的缺憾。由于石菖蒲的主要成分为挥发油类成分，但是中药水煎用药方式及水溶性部位的药理实验表明非挥发性成分尤其是水提物成分值得进一步研究与开发。并且对于石菖蒲活性成分检测，利用现代仪器检测单一成分仍然缺乏统一的标准，这些问题可能是目前石菖蒲化学成分研究的主要症结所在。

1.2 石菖蒲抗癫痫药效物质基础

为研究药物的抗痫作用效果，并深入了解癫痫分子机制，目前已建立多种癫痫动物模型，化学药物点燃模型如戊四氮(pentylenetetrazol, PTZ)、海人酸(kainic acid, KA)、匹罗卡品等；物理方法如电刺激；基因敲除动物模型等，用于抗癫痫药物疗效评价及机制研究[11]。

α-细辛醚是目前石菖蒲药效物质抗痫作用的研究热点。国外研究采用PTZ及KA癫痫小鼠模型研究α-细辛醚抗癫痫作用，发现在两种发作模型中α-细辛醚均可以延长阵挛性和强直性发作的潜伏期，并可以降低癫痫易感性及死亡率，在中枢神经系统中产生抗癫痫作用[12]。还有研究采用毛果芸香碱诱导颞叶癫痫大鼠模型，发现α-细辛醚灌胃给药可以延长大鼠发作潜伏期，降低发作频率，减轻癫痫发作级别，缩短逃避潜伏期，并且在发挥抗癫痫作用的同时可以改善癫痫大鼠的学习记忆能力[13]。有研究分别观察α-细辛醚急、慢性治疗的抗癫痫效果，发现单次急性给药对PTZ诱导的癫痫模型具有微弱的抗惊厥活性。不同剂量α-细辛醚长期给药可以显著拮抗PTZ及锂-匹罗卡品诱导的癫痫发作，并可以显著降低癫痫发生率、癫痫潜伏期、发作严重程度以及死亡率[14]。

α-细辛醇为石菖蒲中固有天然产物，也是α-细辛醚在体内的核心代谢物之一。国内研究通过腹腔注射PTZ建立癫痫大鼠模型，发现α-细辛醇(50 mg/kg)灌胃给药后能够显著降低癫痫发作等级，延长癫痫发作潜伏期，抑制大脑异常放电，保护神经元受损，并且发现α-细辛醇抗癫痫效用与临床西药苯妥英钠相当，优于传统中成药α-细辛醚[15]。还有研究采用PTZ诱导斑马鱼模型，发现α-细辛醇具有显著的抗癫痫活性，可显著延长斑马鱼癫痫发作的潜伏期，缩短癫痫模型斑马鱼游动距离，降低脑电棘波频率与振幅并且具有较小毒性[16]。

β-细辛醚是石菖蒲药理作用的主要物质基础，其抗癫痫活性强且毒副作用低，具有成为一种新型抗癫痫药物的潜力。国内研究采用苦味毒、硫代氨基脲癫痫模型小鼠，发现β-细辛醚具有抗惊厥作用，可以显著降低发作率，延长发作潜伏期，降低发作级别[17]。石菖蒲其他化学成分桉脂素、甲基丁香酚也被发现具有抗癫痫作用。国外研究发现腹腔注射桉脂素可以明显提高PTZ模型小鼠抗惊厥率，降低发作频率及癫痫诱导死亡率，具有显著的抗惊厥作用[18]。国内研究分别采用PTZ和匹罗卡品模型，发现石菖蒲成分甲基丁香酚对癫痫发作具有抑制作用，场电位同步检测仪发现甲基丁香酚能够延长痫样放电密集群峰的潜伏期。在无镁人工脑脊液环境下甲基丁香酚灌流后可降低大鼠海马神经元痫样放电频率。因此，推断甲基丁香酚可以通过作用于中枢神经系统而起到抗癫痫作用[19]。

综上所述，近年来关于石菖蒲药效物质的抗痫疗效研究主要集中于α-细辛醚，α-细辛醇、β-细辛醚、桉脂素、甲基丁香酚，为来源于石菖蒲的抗痫新药研发提供了理论基础。然而该结果仍需要高质量实验研究进行验证。此外，对其他含量偏低成分的药效研究甚少，如何更好利用现代药用辅料，对药效物质进行现代制备，以更好发挥抗痫药效值得药学工作者进一步地思考。

2 石菖蒲抗癫痫机制研究

石菖蒲及其药效物质可能通过调控多种信号通路发挥其抗癫痫的作用，如调节神经递质及受体、调节离子通道、保护神经元、调控凋亡因子、调控炎症因子、抑制一氧化氮释放、抗氧化应激、抑制耐药基因表达等。更重要的是，石菖蒲改善癫痫过程中涉及的信号通路是联合而非独立发挥作用。

2.1 调节神经递质及受体

癫痫发作是神经传递中兴奋性和抑制性因子之间病理性失衡的超兴奋和超同步表现，这种平衡主要是在谷氨酸(glutamate, Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, γ-GABA)之间达成的[20]。GABA 通过与其突触靶点GABAA受体结合产生快速抑制性神经传递, 该类受体功能障碍会导致癫痫发作[21]。兴奋性氨基酸，特别是Glu的过度合成、释放以及 N-甲基-D天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)兴奋性活性增高均与癫痫的发生、发展、维持密切相关[22]。

国外研究通过全细胞膜片钳记录发现在小鼠嗅球脑片制备过程中，α-细辛醚可以抑制神经元僧帽细胞自发放电，使膜电位超极化，且其抑制作用在离子型Glu受体阻滞剂存在时持续存在，但在添加GABA受体阻滞剂后被消除，这表明GABA受体介导了α-细辛醚的对神经元放电的抑制作用[23]。还有研究发现在PTZ和KA癫痫模型中，α-细辛醚可以明显改善癫痫发作，其作用可能依赖于γ-GABAA受体的激活[24]。国内研究显示β-细辛醚能显著下调青霉素点燃大鼠模型脑内NMDAR1和GABA转运体GAT-1的表达，上调 GABAA受体mRNA表达，通过改变兴奋性与抑制性神经递质的失衡状态发挥抗痫作用[25]。还有研究显示β-细辛醚可以通过调节兴奋性递质Glu发挥神经保护作用[26]。

兴奋性与抑制性氨基酸类神经递质相似的变化趋势在多种癫痫模型中均可以观察，递质与受体相互作用及由此触发的一系列反应及其分子机理均受到关注。此外，GAT因可摄取 GABA 进入抵制性神经末稍，从而使细胞外抵制性递质浓度下降，成为癫痫研究及抗痫药物开发的新热点。以上研究表明，适当剂量的α-细辛醚、β-细辛醚均可能通过作用于NMDAR1、GABAAR、GAT-1的表达，调节兴奋与抑制性神经递质的相对水平向着平衡的方向转变，发挥抗癫痫作用。但其如何影响以上作用位点，以及病程中可能的动态变化等确切机制及作用途径有待进一步研究。

2.2 调节离子通道

离子通道是调节神经元兴奋性的基础, 研究发现有多种离子通道基因与癫痫发生有关, 主要包括钠离子通道、钾离子通道和钙离子通道等，编码这些通道的基因突变可影响离子通道正常生理功能，从而导致遗传性疾病[27-28]。目前，抗癫痫药物大约有二十几种, 大多数药物是靶向离子通道靶点而发挥抗癫痫作用。

国外研究采用全细胞膜片钳记录，发现α-细辛醚可以抑制小鼠嗅球脑片制备过程中输出神经元细胞的自发放电，并以浓度和膜电位依赖的方式抑制大鼠脑钠离子通道亚型Nav1.2，可能是α-细辛醚抗癫痫作用机制[23]。国内研究采用细胞流式术和钙离子荧光探针Fluo3/am，发现检α-细辛醚可以降低Aβ1-42诱导的PC12细胞的凋亡率，降低细胞内钙离子浓度，其机制可能与抑制钙离子通道有关[29]。

电压门控钠离子通道是许多抗癫痫药物的靶点，在过去几十年中，有12个靶向电压门控钠通道的抗癫痫药物上市，包括苯妥英钠、卡马西平、拉莫三嗪、奥卡西平以及新药氯桂丁胺等。近年来，寻找能够区分不同电压门控钠离子通道亚型的选择性调节剂已经成为靶向钠通道的药物研发的新方向。综上所述，α-细辛醚对离子通道表现出良好的抑制作用，提示它可能作为离子通道异常引起的遗传性癫痫的备选药物。

2.3 保护神经元

癫痫的发作与大脑神经元的异常活动相关，长期反复发作可能会导致神经细胞损伤，神经元细胞减少，并且受伤的局部组织和神经元丢失常伴有星形胶质细胞激活进而引起患者学习及记忆能力下降，引起认知障碍[30-31]。近年来多数研究显示，药物的神经保护及修复作用能够显著改善机体的学习及记忆能力，同时能够明显缓解和改善癫痫的预后。

国外研究发现石菖蒲挥发油及其主要成分α-细辛醚和β-细辛醚以浓度依赖的方式刺激神经生长因子(nerve growth factor, NGF)诱导的PC12细胞，促进PC12细胞的神经突起生长和神经丝的表达，协同NGF的营养活性增强PC12细胞转录活性，其作用主要是通过cAMP-PKA信号通路介导的[6]。进一步研究发现，石菖蒲挥发油及其主要成分α-细辛醚、β-细辛醚通过减少叔丁基过氧化氢诱导的星形胶质细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的积累，减少细胞损伤，起到保护神经细胞作用[32]。此外，还有国内研究发现β-细辛醚对Aβ1-42诱导星形胶质细胞活化所致PC12细胞损伤的具有保护作用，能促进脑源性营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的释放[26]。

综上所述，石菖蒲药效物质α-细辛醚、β-细辛醚在癫痫模型中可以发挥保护神经元作用，但是目前相关研究较少。α-细辛醚、β-细辛醚是否能够通过保护神经细胞，缓解癫痫发作、改善癫痫导致学习及记忆能力下降，对于癫痫脑病的药物研发具有重要意义，然而其具体作用机制仍需要大量研究证实。

2.4 调控凋亡因子

癫痫发作所致的早期脑损伤可能为细胞坏死，而癫痫晚期脑损伤常伴有程序性细胞凋亡，尤其在发作后一周达到高峰。细胞凋亡是一种由多种基因参与调控的细胞程序化死亡的复杂过程，过度的凋亡会引起神经元退行性疾病。凋亡可引起致B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)家族的表达以及半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)家族的激活，Bcl-2家族作为细胞凋亡的关键调节因子，发挥着细胞凋亡开关的作用，而Caspase-3作为 Caspase家族的核心酶，是凋亡的执行者。

国外研究显示，石菖蒲活性成分桉脂素可以通过介导磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路，上调慢性癫痫大鼠脑中Bcl-2表达，下调caspase-3蛋白，蛋白激酶B激活后能使底物中的苏氨酸、丝氨酸残基磷酸化而发挥广泛的促生存、抗凋亡的作用[18]。国内研究发现石菖蒲与α-细辛醚能明显改善小鼠学习记忆能力，并且能够促使Bcl-2表达快速上升，使癫痫诱导神经元凋亡得到有效控制[33]。近年来，分子水平的研究发现原癌基因(c-fos)基于通过调节转录使与癫痫发生有关的目标基因发生改变，进而造成癫痫病灶的形成。有研究显示α-细辛醚可减少PTZ诱导的斑马鱼癫痫模型的痫样行为，降低c-fos的表达[34]。

综上所述，石菖蒲及其药效物质α-细辛醚、桉脂素可以通过调控凋亡因子改善癫痫诱导神经元损伤，提示其抗痫作用机制可能与减少神经元凋亡、保护神经元细胞有关。神经细胞凋亡在癫痫中发挥重要作用，抑制该过程可为治疗癫痫寻找新的治疗靶点[35]。

2.5 调控炎症因子

癫痫发作后，炎症反应与活化的神经胶质细胞、神经元释放炎症介质，并激活相关的细胞内信号通路如白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TNF-β)、环氧化酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)等[36]。炎症介质也能直接激活表达在致痫组织神经元上的同源受体，后者诱导Glu和GABA 受体及其他离子通道等的转录活性改变，使神经元兴奋性增加，从而促进或导致癫痫发生, 彼此相互促进形成恶性循环[37-39]。

国内研究采用毛果芸香碱癫痫大鼠模型，发现α-细辛醚可以抑制小胶质细胞活化，抑制胞内核因子-κB活化入核，并对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和COX-2表达均有剂量依赖性抑制作用[40]。还有研究发现α-细辛醚发挥抗癫痫作用的同时可以抑制大鼠脑内小胶质细胞活化和炎症因子TNF-α、IL-1β表达，并且可以抑制脑内核因子-κB信号通路的激活。并且通过原代培养大鼠小胶质细胞，发现α-细辛醚可抑制脂多糖诱导的大鼠小胶质细胞免疫炎症反应防止脑细胞的过度损伤，从而有效防止癫痫的发生和改善癫痫症状[41]。

目前已有的研究表明炎症反应贯穿癫痫发生、发展的始终。综上所述，石菖蒲药效物质α-细辛醚抗癫痫作用机制可能与抑制TNF-α、IL-1β等炎性因子及核因子-KB等信号通路有关，为石菖蒲药效物质治疗癫痫提供了新的靶点和实验依据。

2.6 抑制一氧化氮释放

一氧化氮(nitric oxide, NO)是脑组织普遍存在的神经信使，对神经递质起调节作用，三种一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)亚型参与NO的生成，分别是内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、iNOS和神经元型一氧化氮合酶(neuronsal nitric oxide synthase, nNOS)，在癫痫的发病与诱发过程中具有重要的致病作用[42-43]。

国外研究采用PTZ癫痫大鼠模型，发现NO合成抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯与nNOS抑制剂7-硝基吲唑均能扭转α-细辛醚的抗痫作用，因此推测nNOS/NO信号通路可能介导α-细辛醚的抗痫作用，并且通过进一步研究发现iNOS与α-细辛醚对PTZ诱导的癫痫样活性的抑制作用无关[44]。国内研究发现石菖蒲挥发油和水溶性成分均能降低脑组织中NO的含量，减少NO的神经毒性，从而起到保护脑细胞的作用[45]。

NO在癫痫发生发展的病理过程中起着非常重要而又复杂的调节作用，已成为研究热点。虽然目前关于NO在癫痫中作用已经有部分细胞及动物实验研究，但却显示出不一致的结果，既有报道抗癫痫作用，也有报道促癫痫作用的。现有的抗癫痫药物与NO的相关性也受到了关注，有研究发现抗癫痫药物参与调节癫痫患者NO水平，并且有研究提出丙戊酸钠的抗癫痫效果是通过促进NO释放而实现[46]。综上所述，nNOS/NO通路可能参与α-细辛醚抗痫作用机制，然而相比检测NO水平的变化，具体研究哪一种NOS亚型引起的变化可能更有意义，因此仍需作进一步详尽的研究。

2.7 抗氧化应激

相比其他组织，脑组织是代谢最旺盛、耗氧量最高的组织，对氧具有高度的依赖性，极易受自由基氧化损伤。癫痫状态下脑组织中氧化与抗氧化系统失衡、氧化应激标志物的改变提示自由基在癫痫发生中的作用，体现了大脑氧化损伤的程度。癫痫所致的脑组织损伤中几乎都有过氧化脂质(lipid peroxide, LPO)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平的增高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的降低。

国内研究显示α-细辛醚具有强大的抗氧化应激能力，可以提高提高SOD活力，抑制自由基生成，防止癫痫导致的脑细胞过度损伤，减少局部缺氧，从而减少细胞损伤后引起的神经元异常放电，改善癫痫发作[47]。还有研究发现石菖蒲挥发油和水溶性成分对士的宁、青霉素、PTZ所致的癫痫模型均有良好的治疗作用，能使 SOD活性明显升高，脑内 LPO、MDA 水平明显降低，提示石菖蒲挥发油可通过阻止过氧化物形成，发挥对脑组织的保护作用[45,48]。

癫痫发病机制复杂，氧化应激导致的一系列反应是诱发癫痫乃至使病情进展的重要因素之一，因此如何抑制癫痫发病后的氧化应激反应是治疗本病的关键。石菖蒲挥发油、水溶性成分、α-细辛醚均具有一定的清除自由基、抗氧化的作用，它们或通过提高 SOD 的活性，或通过降低MDA、LPO的含量，来对癫痫的氧化应激机制产生影响，从而对癫痫起到一定的治疗作用。因此探讨石菖蒲药效物质对氧化应激的影响可能将成为研究癫痫治疗的方向之一。

2.8 改善耐药性

癫痫反复发作或长时间服用抗痫药物能够引起癫痫患者血脑屏障中多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1, Mdr1)mRNA与其编码的P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)高表达，高表达的P-gp可以将抗痫药物逆浓度梯度外排出脑组织，降低脑组织中药物浓度，从而引起癫痫耐药[49]。耐药性癫痫的主要特征是对多种抗癫痫药物产生了不同程度的耐药性，从而降低了抗痫药物疗效。因此，逆转耐药、增加脑内抗痫药物浓度是改善耐药性癫痫疗效的重要突破口。

国外研究通过体外实验发现α-细辛醚和β-细辛醚可以通过抑制P-gp的药物泵和表达的双重功能，在逆转P-gp介导的多药耐药方面显示出潜在的作用，可以有效逆转多药耐药[50]。国内研究采用侧脑室注射海人酸法建立癫痫大鼠模型，发现高剂量的α-细辛醚可以下调癫痫大鼠海马与皮层中P-gp与Mdr1α mRNA的表达，扭转P-gp介导的癫痫耐药性，促进卡马西平入脑[51]。

生理状态下，血脑屏障可以维持脑内环境的稳态，但病理情况下也会成为脑部治疗药物入脑发挥疗效的重大障碍。石菖蒲作为芳香开窍药，其可逆性的开启血脑屏障，协助其他药物入脑的作用已得到越来越多的重视。上述研究表明，石菖蒲药效物质α-细辛醚，β-细辛醚对多药耐药蛋白的下调作用，有利于抗痫药物在脑组织尤其是海马内的药效发挥。将为α-细辛醚、β-细辛醚与其他P-gp底物结合使用奠定研究基础，也为耐药性癫痫的治疗开辟新的途径。

3 小结

近年来，石菖蒲因具有丰富的药理学作用日益得到研究者重视。临床试验及动物实验研究发现石菖蒲单药及含有石菖蒲复方治疗癫痫效果显著。由于中药所含化学成分复杂多样，药效物质基础和作用机理不明确，致使中药的安全性和有效性长期以来备受质疑，极大地制约了我国传统中药在癫痫治疗方面的发展。因此明确石菖蒲抗癫痫药效物质及其作用机制、靶点尤为重要。综上所述，石菖蒲药效物质可以通过调控多种机制达到改善癫痫发作的效果，主要包括：调节神经递质及受体、调节离子通道、保护神经元、调控凋亡因子、调控炎症因子、抑制一氧化氮释放、抗氧化应激、抑制耐药基因表达等。随着研究的不断深入，单一作用机制的抗癫痫药已被发现具有众多的不足，因此，具有多种作用机制的抗癫痫药将是未来癫痫病治疗的新方向。

尽管石菖蒲及其活性成分的抗痫作用在动物及细胞层面已经得到证实，但是目前对于石菖蒲抗癫痫药效物质的应用开发仍然相对薄弱，尤其是缺少临床安全性和疗效性评估，对临床推广应用有一定限制。目前对石菖蒲化学成分的研究主要集中在挥发油及其中含量较多的α-细辛醚和β-细辛醚的药理作用上，对挥发油中含量偏低成分，特别是非挥发性成分的有关药理作用研究甚少。如何更好利用现代药用辅料，对药效物质进行现代制备，更好发挥抗痫药效值得药学工作者进一步地思考。因此，加强对石菖蒲药效物质作用的分子机制、安全性及与常用抗癫痫西药相互作用的研究，对临床治疗癫痫的有效性和安全性具有重要意义。随着医学科技的发展和研究的不断深入，相信石菖蒲及其药效物质的抗癫痫主要机制及作用靶点将会越来越明确，为石菖蒲相关抗痫新药研发提供参考。