艾灸对于三阴性乳腺癌移植瘤小鼠缺氧诱导因子-1α及糖酵解激酶影响的实验研究

陈军 孙嫘 惠建荣 李秀玉 胡蓉 李静

2019年国家癌症中心发布了最新统计数据，中国女性乳腺癌每年发病约30.4万，高居女性肿瘤发病的首位，尤其是三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)发病率逐年升高，常规治疗十分有限，是目前亟待解决的公共卫生难题。现已证实，TNBC的恶性表型及放、化疗耐受均与其肿瘤细胞代谢方式密切相关[1]。糖酵解是恶性肿瘤显著的生化特征，即使氧供充足，肿瘤细胞依然采用糖酵解作为其获得能量的主要方式，这种代谢称为“瓦伯格效应”[2]。现代研究证实艾灸的生物学机制与干预机体能量代谢模式有关。如，艾灸较针刺可以更有效调节骨骼肌能量代谢[3]；艾灸足三里可提升其穴位局部Na+/K+-ATP酶活性[4]。本课题组前期研究发现，艾灸可缓解晚期肿瘤患者癌因性疲乏，改善生活质量[5]。以上均证明，艾灸可有效参与能量代谢的调节。

本次研究以三阴性乳腺癌细胞移植瘤小鼠为研究模型，观察艾灸对于荷瘤小鼠的干预作用，探究艾灸调控肿瘤代谢的机制是否与抑制瓦伯格效应有关，为探寻TNBC的中西医综合治疗提供研究借鉴和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞株

BALB/c雌性野生小鼠80只，体质量25～30 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006；饲养于26～27℃、12/12小时光照/黑暗交替的环境中；Luci-MB-231细胞株购自于军事医学科学院细胞中心。

1.2 主要试剂与仪器

缺氧诱导因子-1的RNA逆转录试剂盒(Roche公司，批号：RAB1057)。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)(批号：ab92498)、α-酮戊二酸(2-Ketoglutaric acid，α-KG)(批号：ab83431)、己糖激酶(hexokinase2，HK2)(批号：ab273721)、丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2，PKM2)(批号：ab89364)、乳酸脱氢酶-A(lactate dehydrogenase A，LDHA)(批号：ab300637)抗鼠单克隆抗体均购自abcam公司。蛋白裂解液RIPA裂解液(批号：P0013C)、特超敏ECL化学发光试剂盒(批号：P0018AS)、显影定影试剂盒(批号：P0019)均购自碧云天公司。

1.3 动物造模

Luci-MB-231细胞株从液氮中取出，常规复苏并传代至3～4代，调整细胞浓度至1×107/mL收集予以皮下移植。小鼠常规麻醉，仰卧位固定，于右侧上肢腋窝下注入，缓慢推入Luci-MB-231细胞混悬液0.2 mL，成瘤后观察。

1.4 艾灸干预

成瘤后90只小鼠随机分为两组，对照组及实验组各45只，其中每组再随机选出30只用于观察小鼠体质量与生存率并评估；另15只用于样本采集，不计入小鼠体质量及生存率统计。实验组采用艾灸干预(见图1)：穴位参考李忠仁主编的《实验针灸学》，选取关元穴、气海穴、中脘穴。小鼠每日抓取放入固定器固定，每天每穴灸20分钟，连续艾灸6周。对照组进行相同操作，但灸条不点燃。

图1 实验组艾灸干预流程示意图

1.5 指标观测

1.5.1 体质量曲线 模型建立后第2、4、6、8周结束时用电子天平称取动物的体质量，单位g，分析荷瘤小鼠体质量变化的差异。

1.5.2 肿瘤增殖测定 模型建立后第2、4、6、8周，分别于两组样本采集模型小鼠中随机选取3只，若第8周用于样本采集的小鼠存活数不足3只，可从观察生存期的相对应两组模型小鼠中随机选取补充至3只，剥离小鼠皮下瘤体获得样本，电子天平称取瘤重，单位mg。

1.5.3 荷瘤小鼠生存曲线 模型建立后每天观察小鼠生存情况，时间结点为满8周，统计死亡个数与剩余个数，并绘制动物生存曲线。

1.5.4 乳酸水平及乳酸脱氢酶检测 模型建立后第2、4、6、8周，分别于两组样本采集模型小鼠中随机选取3只存活小鼠采血获得血清，若第8周用于样本采集的小鼠存活数不足3只，可从观察生存期的相对应两组模型小鼠中随机选取补充至3只。采用Premier 3000血气生化分析仪测定乳酸值，比色法测定乳酸脱氢酶含量。

1.5.5 实时荧光PCR分析HIF-1α的mRNA水平 在肿瘤增殖测定的基础上，裂解组织并TRIzol提取总RNA，紫外吸收测定RNA溶液浓度和纯度，DEPC去除RNA酶；取3 μg的RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加热至70℃孵育15分钟使样品变性。逆转录酶MMLV 之前先95℃干浴3分钟，得到终溶液即为cDNA溶液；上样，加入引物反应体系，随之将配制好的PCR反应溶液置于实时PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃预变性2分钟，然后按93℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟，最后72℃、7分钟延伸。HIF-1α(Gene ID 54632127)引物设计：Forward primer：CAGGTTCCTTTCCGTCACCC CCCG；Reverse primer: CAGGCGGGCGACGGAACTTGAAG。

1.5.6 蛋白免疫印迹法分析HIF-1α及糖酵解激酶的表达水平 模型建立后第2、8周，在肿瘤增殖测定的基础上，获取样本，RIPA裂解液裂解后、离心后获得蛋白样本，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃沸水浴充分变性蛋白；室温冷却，上样到SDS-PAGE胶加样孔、转膜、BSA封闭，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜；二抗室温孵育1小时，ECL化学发光检测，压片后曝光，显影、定影。检测HIF-1α、α-KG、HK2、PKM2、LDHA的表达。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 艾灸对移植瘤增殖的影响

解剖获得肿瘤组织进行称量(单位mg)，实验组瘤体质量与对照组无统计学差异(P>0.05)。见图2，表1。

图2 各组三阴性乳腺癌移植瘤小鼠瘤体增殖情况

表1 各组三阴性乳腺癌移植瘤小鼠瘤体增殖情况

2.2 艾灸对荷瘤小鼠体质量与生存率的影响

对照组小鼠体质量增加缓慢，且于第6周时体质量出现下降，实验组体质量未见明显降低，6周时两组比较尚无统计学意义；至第8周时，实验组小鼠体质量维持良好，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。并且，实验组8周生存率46.67%，对照组生存率16.67%，实验组生存率明显优于对照组(P<0.05)。见图3。

表2 各组三阴性乳腺癌荷瘤小鼠体质量比较

注：与对照组相比，P<0.05。

2.3 艾灸对荷瘤小鼠血清乳酸、LDHA水平的影响

实验组小鼠血清乳酸及LDHA水平在第6周时均较对照组明显降低(P<0.05)，至第8周时，出现显著性降低(P<0.01)。见表3。

表3 艾灸对三阴性乳腺癌荷瘤小鼠血清乳酸及LDHA水平的影响

2.4 艾灸对荷瘤小鼠HIF-1α的mRNA表达的影响

至第4周时，可以看出实验组HIF-1α的mRNA表达明显下调，与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)，且该差异随时间延续持续存在，至6周、8周仍具有显著差异。见表4。

表4 各组三阴性乳腺癌荷瘤小鼠HIF-1α的mRNA表达比较

2.5 艾灸对荷瘤小鼠糖酵解相关激酶及HIF-1α蛋白表达的影响

于第2、8周时收集肿瘤组织样本。如图4所示，2周时，各组蛋白比较未见明显差异；至第8周时，实验组HIF-1α与α-KG、HK2、PKM2、LDHA的蛋白表达都显著降低。

图4 各组三阴性乳腺癌荷瘤小鼠HIF-1α、α-KG、HK2、PKM2、LDHA蛋白表达情况

3 讨论

关于肿瘤细胞能量代谢特性，诺贝尔奖获得者Otto Warburg提出了著名的“瓦伯格效应”(Warburg effect)：肿瘤细胞偏好于采用糖酵解方式进行葡萄糖代谢，而不是产生ATP效率更高的线粒体氧化磷酸化方式[6]。这也部分解释了为什么能量剥夺往往并没有起到控瘤的作用[7]。研究发现，TNBC之所以较其他类型乳腺癌进展迅速、更容易耐药[8]，晚期患者出现的恶液质、乏力、疼痛[9]，均与瓦伯格效应关系密切。

《灵枢·官能》曰“针所不为，灸之所宜”“阴阳皆虚，火自当之”，中医认为，艾灸具有扶正、固阳等作用，能有效扶助人体正气。正气泛指人体各脏腑、气血的正常功能和抗病能力，当然也包括人体正常而高效的能量代谢模式。翟道荡等研究表明，艾灸关元穴可明显提高肝细胞内ATP分子水平，显著增加了肝细胞的磷酸化潜力，从能量代谢的角度阐述了艾灸抗肿瘤的部分机制[10]。本次研究发现，艾灸确有提高移植瘤小鼠“正气”的作用，能够提高荷瘤鼠的体质量并显著增加其生存率。

研究表明，乳酸及LDHA水平能够精确反映生物体能量获取方式的变化[11]。乳酸、LDHA的水平越高越反映机体在糖酵解应激下的调节模式，即瓦伯格效应越占优势，LDHA越高肿瘤恶性程度越高、进展越快[12]。本次实验以Luci-MB-231系构建荷瘤小鼠，采用艾灸为干预措施，发现艾灸能够降低移植瘤小鼠肿瘤组织的乳酸与LDHA水平，艾灸能够影响瓦伯格效应得到了初步验证。

研究发现，HIF-1α是触发瓦伯格效应的核转录因子[13-14]，会启动下游一系列糖酵解代谢激酶诸如α-KG、HK2、PKM2[15]、LDHA[16]的激活。肿瘤恶性程度越高，HIF-1α表达也越高，并且与恶液质、多药耐药、放疗耐受、免疫逃逸均密切相关[17-18]。研究表明，温度感受器TRPV1、压力感受器PIEZO1和PIEZO2等都能将体表温度或者压力刺激传入机体，撬动神经或免疫反应[19-20]。然而，艾灸如何影响肿瘤目前的基础研究还比较少。本研究发现，艾灸可显著降低HIF-1α的mRNA与蛋白的表达。在此基础上进一步分析下游糖酵解激酶活化水平，发现艾灸能够显著降低α-KG、HK2、PKM2、LDHA的表达。本研究初步证实，艾灸影响瓦伯格效应是通过HIF-1α并进一步影响下游糖酵解激酶实现的。

本次研究发现艾灸可有效提高TNBC模型鼠的体质量及生存率，且初步证实其作用与瓦伯格效应的抑制有关，对于艾灸广泛整合入乳腺癌的综合治疗有现实的科学意义，为传统中医外治手段的专病运用提供实验基础。然而，瓦伯格效应机制十分复杂，影响肿瘤功能也呈现多种多样，艾灸是否也可影响其他转录因子；再者，其对于葡萄糖转运体影响有无作用；又或者，其对于免疫的调节是否也经由代谢实现，这些都有赖于将来更多的发掘与探索。