肺炎链球菌耐药分子机制的研究进展

(1.杭州医学院基础医学与法医学院，浙江省杭州市310053；2.浙江大学医学院病原生物学和微生物学系，浙江省杭州市310058)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)是一种常见的革兰氏阳性双球菌，常寄生于正常人群鼻咽部，学龄前儿童该菌带菌率高达50%，成人也有5%～20%带菌率[1-2]。肺炎链球菌是儿科肺炎、中耳炎和鼻窦炎标本中检出率最高的病原菌，也是儿童社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)主要病原体，近年来还发现该菌可引起免疫功能低下和老年人致死性细菌性脑膜炎和脓毒血症[2-4]。据世界卫生组织(WHO)资料，全球每年死于肺炎链球菌感染的患者约200万，仅次于结核病，中国肺炎链球菌感染性疾病发病率位列全球第二[5]。细菌耐药性是人类面临的重大医学问题之一。目前认为，肺炎链球菌株对抗生素耐药性增强及其耐药菌株日益流行，是该菌感染性疾病发病率不断升高的根本原因[6-8]。众所周知，β-内酰胺类抗生素是临床使用最为广泛的抗生素，其次是氨基糖苷类和大环内酯类抗生素。近年发现，15%～30%的肺炎链球菌菌株为多重耐药(multiple drug resistance，MDR)菌株，也即对上述或其他3个以上不同种类抗生素耐药[6-8]。因此，了解肺炎链球菌耐药分子机制，不仅有利于临床治疗肺炎链球菌感染性疾病和控制耐药菌株流行，对深入研究细菌耐药性和发现药物作用新靶点也有较大意义。

1 常用抗生素和常见细菌耐药机制

临床常用的抗生素有青霉素等β-内酰胺类(β-lactams)、链霉素等氨基糖苷类(aminoglycosides)、红霉素等大环内酯类(aminoglycosides)、氟哌酸等喹诺酮类(quinolones)、多西环素等四环素类(tetracyclines)、克林霉素等林可霉素类(lincomycins)抗生素以及临床偶用的去甲万古霉素等万古霉素类(vancomycins)、多粘菌素B等多粘菌素类(polymyxins)抗生素等，其中β-内酰胺类抗生素使用最为广泛。不同细菌对不同抗生素耐药机制复杂多样，但主要机制如下[1,9-12]：

1.1 产生药物钝化酶

如细菌产生分别水解β-内酰胺类抗生素中青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺酶(β-lactamase)、头孢菌素酶(cephalosporinase)和碳青霉烯酶(carbapenemase)，可裂解β-内酰胺类抗生素分子中的β-内酰胺环，从而产生对β-内酰胺类抗生素的耐药性。

1.2 药物结合的靶分子突变

如β-内酰胺类抗生素结合的靶蛋白称为青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins，PBPs)，若PBPs中与β-内酰胺抗生素结合位点的氨基酸突变，可产生对β-内酰胺类抗生素的耐药性。PBPs本质上是位于细菌表面细胞壁肽聚糖合成相关的内肽酶(endopeptidase)、转肽酶(transpeptidase)和羧肽酶(carboxypeptidase)，β-内酰胺类抗生素通过其β-内酰胺环上的羧基与决定PBPs活性丝氨酸残基的羟基共价结合后使酶活性丧失，细胞壁合成受阻，导致细菌在环境低渗透压中裂解。

1.3 药物膜通道数量和/或功能下降

β-内酰胺类抗生素作用位于细菌表面PBPs而不需要进入菌体内，其他抗生素均作用于细菌核糖体，故必须穿越细菌壁膜进入菌体内才能发挥作用。如细菌的氨基糖苷类抗生素OprH膜通道表达量下降和/或通行功能减弱，均可引起对氨基糖苷类抗生素的耐药性。

1.4 菌体内药物外排

细菌需要将合成的蛋白等产物通过特定装置排出菌体，称为细菌的分泌系统(secretion systems，SS)。迄今发现细菌有1～7型SS(T1SS～T7SS)，其中T1SS和T2SS参与菌体内药物外排，如T1SS中ABC药物外排泵。

1.5 药物活性转化受阻

此种耐药机制少见。抗结核药物异烟肼(isoniazid)进入结核分枝杆菌后必须经细菌katG基因表达的产物过氧化氢酶和过氧化物酶氧化后，才能转变为具有抑制结核分枝杆菌活性的中间产物，若katG基因表达下降，可表现为对异烟肼耐药。

2 肺炎链球菌耐药机制

2.1 对β-内酰胺类抗生素的耐药机制

β-内酰胺类抗生素是治疗肺炎链球菌感染的首选药物，临床常用青霉素类和头孢菌素类。与金黄色葡萄球菌等绝大多数病原性球菌不同，一般公认为肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶或无β-内酰胺酶活性[13]。在GenBank公布的肺炎链球菌全基因组序列中，除早年耐药R6株有两个产物注释为金属β-内酰胺酶超家族蛋白(metallo-beta-lactamase superfamily protein)的基因(spr0538和spr1490)外，多重耐药ATCC700669株和不耐药ATCC49619株基因组中均无β-内酰胺酶编码基因[14-16]。

2.1.1 PBPs PBPs突变被认为是细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制之一，突变后的PBPs与β-内酰胺类抗生素的亲和力降低，导致耐药性产生[17]。PBPs可分为低相对分子质量(low molecular weight，lmw)和高相对分子质量(high molecular weight，hmw)两大家族，低相对分子质量只有PBP3，高相对分子质量有5个PBPs，分为A类和B类，A类有PBP1a、PBP1b和PBP2a，B类有PBP2b和PBP2x。肺炎链球菌表达所有6个PBPs，其中PBP1a、PBP2b和PBP2x与耐药性关系更为密切，PBPs突变可能是该菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因[18]。文献[19]报道，肺炎链球菌pbp2B基因第二个保守基序SSN附近T445A突变使其对青霉素的亲和力下降了65%。另有文献[20]也发现，肺炎链球菌pbp2x基因活性位点基序S337TMK中T338G/A和M339F/L突变可降低细菌对β-内酰胺类抗生素的亲和力。国内文献[21]报道，当青霉素对肺炎链球菌株MIC>2 mg/L时,大多数菌株pbp1a和pbp2b基因发生了多位点突变。肺炎链球菌的PBPs点突变可产生累积效应，导致细菌耐药性增强[22]。由于肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶，因此PBPs突变可能是该菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制，值得进一步深入研究。

2.1.2 murM基因 肺炎链球菌murM基因产物为氨基酰连接酶，催化Ala-tRNAAla或Ser-tRNASer与肽聚糖合成中间产物Ⅱ的连接，此连接物可使细菌对青霉素、头孢噻肟/头孢曲松高水平耐药，但高水平耐药必须发生在菌株有pbp1a、pbp2b、pbp2x基因突变的基础上[23]。

2.1.3 细菌感受态 细菌感受态(competence)是指细菌细胞膜通透性明显增强而能从环境中摄取大分子物质的独特状态。人工用化学试剂能使许多细菌处于感受态，但能自然产生感受态的细菌很少。肺炎链球菌在其高水平comC基因产物感受态刺激肽(competence stimulating peptide，CSP)诱导下自然形成感受态，comD/comE基因产物跨膜组氨酸激酶(histidine kinase，HK)/胞质转录调节蛋白(transcription regulation protein，TRP)二元信号系统(two-component signaling system，TCSS)上调CSP表达。HK抑制剂氯氰碘柳胺(closantel)作用肺炎链球菌后，细菌感受态缺陷，对头孢胺噻等β-内酰类抗生素的耐药性显著增强，此耐药性产生机制与PBPs突变无关[24]。

2.1.4 CiaH/CiaR-TCSS变异 肺炎链球菌CiaH胞外区可感受环境中Ca2+水平变化，胞内区具有HK活性，可磷酸化激活下游作为TRP的CiaR，CiaR活化后可调控多个靶基因转录，从而参与细菌产生细菌素、维持细胞壁完整性、黏附定殖能力与毒力以及对β-内酰胺类抗生素的耐药性。CiaH或CiaR基因敲除，可导致肺炎链球菌产生与PBPs突变无关的对青霉素和头孢噻肟高耐药性[25-26]。文献[27]报道，CiaH/CiaR抑制肺炎链球菌形成感受态，显著提高pbp2x突变株对细胞壁抑制剂介导细菌溶解的抵抗力，CiaH/CiaR失活后细菌可产生对抗生素耐药性。

2.1.5 cpoA基因 肺炎链球菌cpoA基因产物为糖基转移酶样蛋白，可调节细胞壁合成并参与脂质转运，使肽聚糖缺陷菌株仍能生存，但该基因敲除后细菌只能形成低水平迟发性感受态，同时产生与PBPs突变无关的对哌拉西林耐药性[27]。

2.1.6 StkP-PhpP信号偶联 肺炎链球菌stkP和PhpP基因组成操纵子结构(stkP-PhpP)，前者表达产物是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，STK)，后者是PP2Cc型磷酸酶(phosphotase)，两者组成StkP-PhpP信号偶联(signal couple)，在细胞壁合成、细胞生长和分裂繁殖、细菌毒力等方面发挥重要作用[28]。文献[29]首次报道，stkP基因与肺炎链球菌产生PBPs非依赖青霉素耐药性密切相关。其他文献[30]报道，亚致死量青霉素和头孢噻肟可诱导肺炎链球菌表达PhpP，PhpP基因敲除后可导致StkP磷酸化，产生与PBPs突变无关的对青霉素和头孢噻肟高耐药性。研究发现，肺炎链球菌CiaH/CiaR-TCSS中CiaR可与3个pbps基因启动子结合并调控其表达[26]。文献[31]报道，肺炎链球菌CiaR也可作为StkP激酶下游TRP，与StkP组成StkP/CiaR-TCSS参与亚致死量青霉素和头孢噻肟诱导的细菌耐药性产生。

2.2 对大环内酯类抗生素的耐药机制

由于肺炎链球菌对青霉素等β-内酰胺类抗生素耐药率不断升高，大环内酯类抗生素成为临床上治疗肺炎链球菌感染性疾病常用药物之一，但其广泛使用导致许多国家和地区逐渐出现了大环内酯类抗生素耐药肺炎链球菌菌株并开始流行。根据大环内酯类抗生素耐药表型差异可将肺炎链球菌分为M型和MLSB型。M型菌株具有mefA/E基因，对14元环(如红霉素等)和15元环(如阿齐霉素等)大环内酯类抗生素低水平耐药，但对16元环(如麦迪霉素、螺旋霉素等)大环内酯类以及林可霉素类抗生素敏感。MLSB型菌株同时具有mefA/E和ermB基因，对大环内酯类和林可霉素类抗生素均耐药。肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要是ermB基因产物甲基化酶对大环内酯类抗生素结合核糖体的位点进行甲基化修饰和mefA/E基因产物组成的药物主动外排泵外排功能增强，少数菌株可因核糖体突变对大环内酯类抗生素耐药[32-35]。

2.2.1 核糖体甲基化酶修饰 ermB基因产物是核糖体甲基化酶。大环内酯类抗生素关键结合位点为肺炎链球菌核糖体的50S亚基23S rRNA 2 058位腺嘌呤残基，核糖体可使该腺嘌呤残基二甲基化，导致大环内酯类抗生素结合核糖体的能力以及亲和力显著下降。例如，仅有ermB基因的肺炎链球菌菌株，即可表现为对大环内酯类抗生素高水平耐药(如红霉素MIC>64 mg/L)，但仅有mefA基因的肺炎链球菌菌株对大环内酯类抗生素低水平耐药(如红霉素MIC为1～32 mg/L)。

2.2.2 药物主动外排增强 由mef基因和mel基因编码的主动外排泵介导。不同细菌mef基因有mefA、mefE和同源物mefI，但序列同源性均高达90%以上，可利用质子流驱动将大环内酯类抗生素从菌体内胞中排出。mel基因又称为msrD基因，与金黄色葡萄球菌mrsA基因同源，编码ABC药物外排泵ATP转运蛋白，可将大环内酯类抗生素从核糖体中置换出来并转移至mef外排泵进行外排。肺炎链球菌mefE基因产物为405个氨基酸组成的外排泵蛋白，与mel基因产物一起作为双组分外排泵运行，共同介导细菌对大环内酯类抗生素的耐药性。

2.2.3 核糖体突变 近年发现少数肺炎链球菌菌株核糖体突变也可导致对大环内酯类抗生素耐药，如核糖体23S rRNA突变和/或核糖体蛋白L4和L22编码基因突变。

2.3 对喹诺酮类抗生素的耐药机制

喹诺酮类抗生素由人工合成，故一些研究将其称为抗菌药物而非抗生素，临床上主要用于治疗泌尿生殖道系、呼吸道和腹部感染。喹诺酮类抗生素通过抑制细菌DNA合成来达到抗菌效果，通常有两个药物作用靶点：参与DNA复制的DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ。对大多数革兰氏阳性菌，环丙沙星等喹诺酮类抗生素主要抑制拓扑异构酶Ⅳ、其次是DNA回旋酶，对革兰氏阴性菌则相反。由于对青霉素等β-内酰胺类抗生素耐药的肺炎链球菌菌株流行，临床治疗儿童肺炎链球菌感染性疾病时使用氟喹诺酮类抗生素的情况也日趋增多。肺炎链球菌对氟喹诺酮类抗生素主要有两个耐药机制：DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ中喹诺酮类耐药决定区域(quinolone resistance-determining region，QRDR)变异以及药物外排泵作用增强[36-37]。

2.3.1 QRDR变异 DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ均为两个亚基组成的异源四聚体。DNA回旋酶两个亚基分别由gyrA和gyrB基因编码，拓扑异构酶Ⅳ两个亚基分别由parC和parE基因编码，任一亚基突变均有可能对氟喹诺酮类抗生素产生耐药性。gyrA和parC基因中一段核苷酸序列与喹诺酮类耐药密切相关，称为QRDR，gyrA或parC基因QRDR突变均导致肺炎链球菌对喹诺酮类抗生素低水平耐药，gyrA和parC基因QRDR均突变时，可产生对氟喹诺酮类抗生素高水平耐药性。

2.3.2 药物主动外排增强 肺炎链球菌主动外排喹诺酮类抗生素是耐药的重要机制，但主要引起低水平耐药。有研究发现，25个医疗中心分离的205株喹诺酮类抗生素耐药肺炎链球菌中68%无QRDR突变，但外排泵抑制剂利血平作用后，这些耐药菌株对喹诺酮类抗生素敏感[38]。

3 肺炎链球菌血清型与耐药性关系

根据荚膜多糖及其抗原性差异，肺炎链球菌可分为不同血清型[39]。近年有研究报道，不同血清型肺炎链球菌菌株对β-内酰胺类抗生素耐药性特异性差异较大，致病性也有所不同[40]。研究发现，肺炎链球菌19A、19F、35B、6A、6B、23A、9V、15A和14血清型显示出较高的青霉素耐药率，19A、6A、19F、6B、15A、9V和14血清型显示出较高的红霉素耐药性水平[6]。在中国儿童中流行的肺炎链球菌血清型主要有19F、19A、14、6A/B和23F，其中19F其次是19A血清型对多种抗生素的耐药率高于所有其他血清型[5,41]。

4 小结和展望

肺炎链球菌是常见病原性革兰氏阳性双球菌，临床上通常采用β-内酰胺类抗生素治疗。由于近年来β-内酰胺类抗生素耐药肺炎链球菌菌株日趋流行，临床上也采用其他抗生素治疗肺炎链球菌感染性疾病，其中以大环内酯类和喹诺酮类抗生素较为常用。肺炎链球菌耐药机制复杂多样。迄今未发现肺炎链球菌能产生β-内酰胺酶，该菌对β-内酰胺类抗生素耐药主要是PBPs突变，其次是与PBPs突变无关的介导细菌感受态的ComD/ComE-TCSS以及调控细胞壁合成或完整性的CiaH/CiaR-TCSS和StkP-PhpP信号偶联相关基因突变，其耐药机制迄今未完全明了。肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要是ErmB甲基化酶对药物作用的核糖体靶点甲基化修饰和MefA/E药物外排泵功能增强。肺炎链球菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制是DNA回旋酶和/或拓扑异构酶Ⅳ中QRDR变异和药物外排作用增强。肺炎链球菌血清型与耐药性也有一定关系，其中19F和19A血清型不仅常在临床病人中检出，同时对多种抗生素有较高耐药率，其机制有待于进一步研究。此外，耐药是细菌与抗菌药物相互作用的结果。因此，研究并阐明细菌感知环境中抗菌药物并进行适应性应答与耐药机制直接相关，如β-内酰胺类抗生素诱导其受体分子PBPs结合抗生素位点或基序(motif)突变使其与抗生素结合能力下降甚至消失，通过细菌二元信号传导系统感知环境中氨基糖苷类和大环内酯类以及喹诺酮类等作用于细菌核糖体的抗生素分子后下调其入胞膜通道表达或降低抗生素通透率，通过细菌二元信号传导系统感知菌体内抗生素并激活细菌分泌系统外排抗生素的作用与机制，将使人们对细菌耐药的本质有更为深入的了解，也可为新型抗生素研发提供思路和依据。