温阳化浊通络方治疗系统性硬化病的研究进展

2022-01-01王倩，吕芹，卞华

南阳理工学院学报 2021年4期

王倩，吕芹，卞华

(1.南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室河南南阳 473004； 2.南阳理工学院张仲景国医国药学院河南南阳 473004； 3.南阳医学高等专科学校河南南阳 473061)

系统性硬化病(Systemic sclerosis, SSc)是一种病因不明的复杂结缔组织疾病，具有多器官受累和异质性临床表现。该病的发生发展主要表现为3个典型的病理过程：自身免疫异常，血管损伤和纤维化。这3个病理过程并不是相互独立的，目前认为疾病发展早期是以微血管损伤和炎症等病理改变为始动因素，其中微血管损伤诱导的炎症和自身免疫反应直接或间接刺激成纤维细胞的活化，导致纤维化的发生[1]。截至目前，临床上对于SSc的西医治疗方案主要是运用环磷酰胺、甲氨蝶呤、D-青霉胺，以及抗TGF-β等抗体来调节免疫异常、改善微循环和抑制纤维化[2]。但是，长期服用这些药物所带来的副作用以及巨大的经济负担，使得患者牢骚满腹。与此同时，中医药在SSc的治疗中显示出令人惊喜的潜力。本课题组经过十多年的临床实践和基础研究，提出根据“肺脾肾-皮毛”相关理论治疗SSc的新思路，并在此基础上创制温阳化浊通络方。本文就温阳化浊通络方治疗SSc的研究进展作出阐述。

1 温阳化浊通络方治疗SSc的理论基础

中医典籍无SSc的相关记载，根据其临床表现，SSc类似于中医之“皮痹”。《诸病源候论》表述曰：“风湿痹痛之状，或皮肤顽厚，或肌肉酸痛……。此证由于素体气血虚弱，卫外不固，腠里不密，外感六淫之邪……，而成痹阻，致发热关节酸痛，皮肤受损，则肿厚苍白而为皮痹。”《妇人大全良方》认为：“脾肺气虚，肌肤不仁，手足麻木。”《古今图书集成医部全录卷二十》曰：“肺主秋，亦主皮，肺气衰则三气入皮，故名之曰皮痹”。《临证指南医案》曰：“痹者，……皆由气血亏损，腠理疏豁，风寒湿三气得以乘虚外袭，留滞于内以致湿痰、浊血流注凝涩而得之”。中医学理论认为，肺与皮毛相表里，两者相互影响，疾病也会相互传变。另外，脾为后天之主，运化津液，充于皮肤。肾为先天之主，“西方生燥，燥生金，金生辛，辛生肺，肺生皮毛，皮毛生肾”，“皮毛润泽则又能生养于肾”。由此可知，皮痹之疾虽在皮毛，但其病因与肺脾肾密切相关。其病机为本虚标实，本虚是肺脾肾之阳气虚；标实是浊邪痰瘀，阻滞脉络。因此，根据“肺脾肾-皮毛”相关理论，我们以温补肺脾肾之阳、化浊通络为原则，创制温阳化浊通络方(药物组成：黄芪、党参、淫羊藿、桂枝、积雪草、白芥子等)。其中，黄芪补气固表，党参补脾肺之气，淫羊藿补肾阳，祛风湿，三者共为君药；积雪草活血化瘀，白芥子温通经络，去除浊邪，共为臣药；桂枝等辛温通络是属佐使之用。

2 温阳化浊通络方治疗SSc的临床研究

基于“肺脾肾-皮毛”相关理论的温阳化浊通络方已经广泛应用于临床治疗SSc，并显示出令人满意的治疗效果。临床研究结果显示，温阳化浊通络方能够显著改善SSc患者的皮肤积分、疾病活动指数、关节功能积分、握力、齿距、指距，降低雷诺现象的发生次数，明显改善FVC、DLco等肺功能指标[3,4]。经温阳化浊通络方治疗后，SSc患者血IgG、ESR均明显下降[5]。另外，温阳化浊通络方还提高了SSc患者对强的松、青霉胺的耐受性，减轻其西医治疗的副作用[3]。这些研究结果表明，温阳化浊通络方能够显著改善SSc患者的生理机能、精神健康，提高患者生存质量。

3 温阳化浊通络方治疗SSc的药效物质基础研究

我们通过系列临床研究已经证实了温阳化浊通络方对于SSc具有良好的治疗效果。中药复方在疾病治疗中能够同时作用于多个靶点，这也是中医药的优势之处。但是，由于其成分复杂，也造成了中医药治疗疾病的作用机制很难彻底明晰。因此，开展中药的药效物质基础研究，分离中药的有效部位或有效成分，既有助于理解中药发挥作用的机制，又能够在此基础上对中药进行优化，保留有效成分的同时剔除有害物质。在本课题组既往研究中，我们制备了温阳化浊通络方的水溶性部位、正丁醇部位、乙醚部位、乙醇部位、乙酸乙酯部位的不同溶剂提取物，通过小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型分别探讨其对SSc的免疫调节作用。结果显示，温阳化浊通络方的水溶性部位和正丁醇部位能够显著抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，同时显著改善DTH小鼠脾指数和胸腺指数[6]。因此，温阳化浊通络方对于SSc的免疫调节作用可能是其水溶性部位和正丁醇部位。

4 温阳化浊通络方治疗SSc的作用机制

前期，本课题组通过离体细胞实验和动物模型相结合，采用现代分子生物学、细胞生物学、免疫学、病理学等技术揭示了温阳化浊通络方治疗SSc主要是通过以下4种作用机制来实现的。

4.1 调控Th17/Treg细胞失衡和B细胞活化

长期以来，SSc已经被证实在发病过程中存在先天性和适应性免疫系统的异常，包括受累组织的慢性单核细胞浸润、细胞因子和生长因子表达水平的失调以及自身抗体的产生。组织学研究表明，在 SSc 的早期阶段，血管周围炎症浸润伴随着内皮细胞损伤，炎症渗出的主要细胞为巨噬细胞和T淋巴细胞。在众多的T细胞类型中，辅助性 T细胞 17 (T help cell 17，Th17) 和调节性 T 细胞( regulatory T cells，Treg)与SSc发病的相关性最为密切[7]。Th17 细胞与 Treg 细胞的功能表现为相互拮抗，在正常人体内两者保持动态平衡，维持着正常的免疫应答反应。研究已经证实，Th17/Treg细胞失衡是SSc发病的关键因素[8]。本课题组研究发现，在小鼠迟发型超敏反应模型(DTH)中，温阳化浊通络方能够明显减轻 DTH 小鼠耳肿胀、降低小鼠的脾指数和胸腺指数，抑制 T、B 淋巴细胞增殖[6]。另外，还发现 SSc 患者外周血中 Th17 细胞比例、Th17/Treg 比值，以及血清IL17 的含量均高于健康人群，而 Treg细胞比例，以及血清 IL10 的含量低于健康人群。通过给予温阳化浊通络方治疗，能够显著降低SSc 患者的 Th17 细胞比例、Th17/Treg比值，以及血清 IL17 的含量，同时上调 Treg 细胞比例，以及血清IL10 的含量[9,10]。在体外实验中，进一步研究表明，温阳化浊通络方抑制 Th17 细胞增殖的作用机制和miR-155/IL-6/IL-6R通路以及JAK2/STAT3信号通路有关[10,11]。这些研究结果表明温阳化浊通络方能够通过调节 SSc 患者 Th17/Treg 细胞失衡而发挥治疗作用。

此外，在SSc患者和动物模型中，均发现B淋巴细胞稳态存在异常，其激活标记物，如CD80、CD95、HLA-DR、B 细胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)，在某些 B 细胞亚群(主要是记忆 B 细胞)和患者血液中表达上调[12]。在功能上，B淋巴细胞同T淋巴细胞一样，两者共同维持着机体正常的免疫耐受。因此，SSc患者体内B淋巴细胞的异常活化与其自身免疫异常的形成密切相关。另外，B淋巴细胞还是 TGF-β 的来源并表达 TGF-β 的受体，而TGF-β是导致SSc纤维化形成的关键细胞因子之一[13]。本课题组的既往研究结果显示温阳化浊通络方能够抑制血清BAFF水平，进而降低SSc患者皮肤积分和疾病活动指数[5]，表明温阳化浊通络方能够通过调控B细胞活性，发挥治疗SSc的作用。

4.2 抑制成纤维细胞的激活和增殖

纤维化可在 SSc 的早期和晚期发生，几乎可以发生在 SSc 的所有器官中，但在皮肤、肺、心脏和胃肠道中最为突出。纤维化过程依赖于成纤维细胞的过度活化、重编程和正常稳态特性的丧失，导致它们在外周组织中转化为增殖和代谢活跃的肌成纤维细胞。成纤维细胞的异常激活并转化为表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞是纤维化形成和发展的中心环节[14]。研究发现，Wnt-1蛋白和人皮肤成纤维细胞共同孵育，能明显增加成纤维细胞 α-SMA mRNA和蛋白表达，刺激Ⅱ型胶原释放，表明Wnt-1能诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化[15]。本课题组的既往研究显示，温阳化浊通络方能够显著抑制Wnt-1诱导的成纤维细胞中α-SMA的表达水平，并且抑制其迁移能力[16]，表明温阳化浊通络方能够抑制成纤维细胞的激活，进而发挥抑制SSc纤维化的作用。

纤维化除了与成纤维细胞的过度活化相关之外，SSc患者皮肤、肺、心脏和其他器官的组织学研究显示成纤维细胞数量显著增加，表明成纤维细胞的增殖与SSc纤维化的发生密切相关[17]。因此，抑制成纤维细胞的增殖和激活是治疗SSc的策略之一。本课题组既往研究结果显示温阳化浊通络方能够阻止有丝分裂的成纤维细胞从G0期进入S和G2/M期[18]，表明温阳化浊通络方能够通过调控细胞周期抑制成纤维细胞的增殖。进一步研究表明，在体外实验中，温阳化浊通络方抑制成纤维细胞cyclin D1和survivin的表达水平，发挥促细胞凋亡和抑制细胞增殖的效应[19]。

4.3 调控细胞外基质代谢

细胞外基质(extracellular matrix, ECM)主要由不同的胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ型)、糖胺聚糖(例如透明质酸)、多糖和糖蛋白(例如纤连蛋白、多功能聚糖、双糖蛋白聚糖、核心蛋白聚糖)组成。研究表明，SSc纤维化的发生发展与ECM的代谢密切相关，其机制主要为ECM生成和降解的动态平衡被打破，造成降解不足而合成相对过多，从而导致纤维化的发生[20]。成纤维细胞目前被公认为是ECM的主要来源细胞，正常情况下的成纤维细胞处于静息状态，而SSc患者成纤维细胞数目明显增多，同时功能也存在过度活化现象。因此，数量过多和功能亢进的成纤维细胞产生了过量的ECM，最终导致了SSc纤维化的发生，故而抑制ECM的生成也是SSc治疗的策略之一。上述已经提到温阳化浊通络方能够抑制成纤维细胞的增殖和激活，因此，我们可以推断温阳化浊通络方能够通过抑制ECM的生成发挥抗SSc纤维化的作用。这个推断也已经被我们的研究所证实，SSc动物模型和体外细胞实验结果显示温阳化浊通络方能够抑制成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白的生成，改善SSc皮肤纤维化[21-23]。另外，我们的研究结果还揭示了温阳化浊通络方对胶原蛋白、纤连蛋白等ECM生成的调控是通过抑制结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)，TGF-β1/smad信号通路以及Wnt/β-catenin信号通路来实现的[22,24-26]。

温阳化浊通络方除了抑制ECM的生成之外，还能够调控ECM的降解。正常情况下，ECM的生成和降解存在动态平衡，这是器官正常发育和修复的关键。ECM的降解主要是由金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)蛋白家族负责，其家族成员包括20多种。MMP 是锌依赖性内肽酶，能够降解 ECM 的几乎所有成分，尤其是ECM中的基质结构和胶原蛋白。除了MMP之外，体内还存在大量金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)，可通过与基质MMP-2结合，有效降低基质MMP-2的活性，从而抑制 MMP-2 对 ECM 的降解。MMPs 及其天然抑制剂 TIMPs 始终处于动态平衡状态，以维持组织中 ECM 的正常表达和沉积。然而，在SSc患者组织中，MMPs和TIMPs蛋白表达水平，以及MMPs/TIMPs比例存在异常，最终导致了ECM降解的失调，引起SSc纤维化的发生[27]。我们的既往研究显示，温阳化浊通络方能够显著上调MMP-9水平和MMP-9/TIMP-1比值，同时降低TIMP-1的表达[25]。因此，温阳化浊通络方调控ECM的降解是其抗SSc纤维化的另一机制。TGF-β 能够通过降低 MMP 和增加TIMP的表达来促进胶原沉积并抑制胶原降解[27]，因此温阳化浊通络方调控ECM的降解可能是通过抑制TGF-β信号通路实现的。

4.4 抑制血管内皮细胞损伤，改善微循环

临床症状和组织学数据表明，血管损伤和内皮损伤是SSc最早的致病事件[28]。活化的内皮细胞能够上调血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，粘附分子，如血管细胞粘附蛋白1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、血浆细胞间粘附分子(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和 E-选择素(E-selectin)，以及趋化因子，如 MCP-1、MIP-1α 和 MIP-1β的表达，导致炎症细胞的募集。内皮细胞还产生内皮素-1(Endothelin-1，ET-1)和CTGF，刺激血管平滑肌细胞增殖和ECM的产生。血管壁的逐渐增厚导致毛细血管腔变窄和微血管系统的功能失调，从而造成组织缺氧和氧化应激。此外，在 SSc 患者中还发现存在血管修复和血管生成功能缺陷，造成疾病的慢性进展。因此，保护血管，改善微循环是治疗SSc的重要策略之一。在我们既往研究中，温阳化浊通络方能够显著改善SSc患者血管的管襻状态、血管流态和襻周状态积分。另外，经温阳化浊通络方治疗后，SSc患者血液中的循环内皮细胞数量显著减少[29]。这些结果表明温阳化浊通络方具有改善SSc患者甲襞微循环，保护血管的作用。