响应面法优化锦绣杜鹃花色苷的提取工艺

张 梅， 李 悦， 张燕杰， 洪晓晖， 雷成万

(闽江学院材料与化学工程学院 福建 福州 350108)

食用色素作为重要的食品添加剂，赋予食品各种各样的色泽。但合成色素因多具有致癌性、致突变性等毒副作用，其应用受到很大的限制[1，2]，而天然色素因具有营养、安全、药理作用等优点，渐渐地为人们所青睐[3-5]。杜鹃花色苷是从杜鹃花中提取的一种天然色素，研究表明其花色苷具有较好的稳定性和抗氧化性，营养价值高，药理作用强，是一种良好的食品着色剂[6，7]。而锦绣杜鹃(RhododendronpulchrumSweet)为杜鹃花属植物，花中含有丰富的花色苷成分，是一种潜在的花色苷提取原料，具有广阔的开发应用前景。本文以锦绣杜鹃花为花色苷的提取原料，结合超声辅助提取技术的优点，通过响应面设计法优化锦绣杜鹃花色苷的提取工艺， 旨在为花色苷的高效提取提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

锦绣杜鹃花于闽江学院校园内采集，45 ℃恒温干燥后粉碎，过 80 目筛，存干燥器内备用。无水乙醇、盐酸等试剂均为分析纯。

723N 可见风光光度计，SB-5200DT 型超声波清洗器，TDL80-2B 台式离心机，AL104 电子分析天平，GZX-9146MBE 电热鼓风干燥箱，PHS-3C 型 pH 计。

1.2 试验方法

1.2.1 锦绣杜鹃花色苷的提取及含量测定

称取 1 g 锦绣杜鹃花粉末，置于 250 mL的锥形瓶中，按设计的工艺条件加入一定量的乙醇，在设定的温度下进行超声提取，抽滤，得到的滤液为花色苷提取液，备用。采用摩尔消光系数法[8，9]，将提取液稀释一定倍数后，在 535 nm 波长处测定吸光度值 A，计算锦绣杜鹃花色苷得率。

花色苷得率/mg·(100g)-1= [(A×V)/(98.2×M)]×100

式中，A为吸光度值；V为提取液稀释的体积(mL)；M为样品重量(g)；98.2为1%浓度的花色苷 1 moL 消光系数。

1.2.2 单因素试验

(1)乙醇体积分数(乙醇的体积与水体积的百分比)对花色苷得率的影响

设定提取时间 35 min，超声温度 55 ℃，液料比 90∶1( mL·g-1)考察乙醇体积分数为 45%、55%、65%、75%、85%时对锦绣杜鹃花色苷得率的影响。

(2)提取时间对花色苷得率的影响

设定乙醇体积分数为 65 %，超声温度 55 ℃，液料比 90∶1，考察提取时间为 15、25、35、45、55 min时对锦绣杜鹃花色苷得率的影响。

(3)液料比对花色苷得率的影响

设定乙醇体积分数为 65 %，超声温度 55 ℃，提取时间 45 min，考察液料为 50∶1、70∶1、90∶1、110∶1、130∶1时对锦绣杜鹃花色苷得率的影响。

(4)超声温度对花色苷得率的影响

设定乙醇体积分数为 65 %，提取时间 45 min，液料比110∶1，考察超声温度为 35、45、55、65、75 ℃时对锦绣杜鹃花色苷得率的影响。

1.2.3 响应面试验设计

结合单因素实验结果分析，以超声温度A、乙醇体积分数B、液料比C为自变量，花色苷得率为响应值，根据 Box-Benhnken 中心组合实验设计 3 因素 3 水平响应面试验，以确定锦绣杜鹃花色苷最佳提取工艺[10-12]。采用 Design-Expert 10 软件分析本次响应面实验结果，因素与水平见表 1。

表1 响应面分析因素与水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对花色苷得率的影响

由图1可知，锦绣杜鹃花色苷得率受乙醇体积分数的影响较大。当乙醇体积分数不大于 55 % 时，花色苷得率随着乙醇体积分数的增大处于增加状态，当乙醇体积分数达到65%时，花色苷得率达到最大值 22.17 mg·(100g)-1，乙醇体积分数继续增加，花色苷得率反而下降。这可能是因为65%的乙醇与锦绣杜鹃花中的花色苷物质极性相似，但随着乙醇体积分数的继续上升，可能会导致锦绣杜鹃花中其他极性杂质物质加速溶出，从而使花色苷溶出降低。

图1 乙醇体积分数对花色苷得率的影响

2.1.2 提取时间对花色苷得率的影响

由图2可以看出，锦绣杜鹃花色苷得率随提取时间加长，得率有所增加，当提取时间不大于 45 min时，花色苷得率呈现缓慢递增趋势，而在大于 45 min之后花色苷得率基本保持不变，所以45 min之后继续增加提取时间对实验得率提高作用不明显。这可能是因为超声产生空穴等作用，会破坏细胞壁，从而加速花色苷溶出，时间过短，作用不明显，花色苷没有充分溶出，所以得率不高，但时间过长，得率不增加，反而会因为花色苷分解而下降。

图2 提取时间对花色苷得率的影响

2.1.3 液料比对花色苷得率的影响

从图 3 可知，液料比不大于110∶1，杜鹃花花色苷得率呈现逐渐递增的趋势，当液料比达到110∶1 时，花色苷得率达到最大值 22.24 %。在液料比大于110∶1 后，花色苷得率则呈递减趋势。如果液料比太小，溶剂在细胞内外的浓度差不够，影响细胞内花色苷往外扩散的速率，从而影响溶液中花色苷的得率，液料比太高，则会降低花色苷溶液中的浓度，增加后继浓缩难度。

图3 液料比对花色苷得率的影响

2.1.4 超声温度对花色苷得率的影响

从图 4 可知，当超声温度不大于55 ℃ 时，花色苷得率随超声温度升高而不断增加，在达到 55 ℃ 时花色苷得率最高，为 22.35 %，在温度大于55 ℃ 时，得率呈下降趋势。说明一定程度的温度升高有利于花色苷的溶出，但花色苷不稳定，温度太高则可能使花色苷结构被破坏，得率反而降低。

图4 超声温度对花色苷得率的影响

2.2 响应面优化

2.2.1 响应面实验结果分析

通过 Design-Expert 10 软件对表 2 中的响应面实验数据进行拟合分析后，得到二元多项回归方程模型：Y=22.10+0.27A+0.21B-0.46C-0.62AB+0.47AC-0.012BC-1.54A2-1.12B2-1.00C2。方差分析结果见表 3。

表2 响应面实验结果

由表 3 可知，各个因素对锦绣杜鹃花色苷得率的影响程度依次为：液料比(C)> 超声温度(A)>乙醇体积分数(B)。其中对花色苷得率的影响情况为：一次项C、二次项A2、B2、C2和交互项AB对花色

表3 回归方程方差分析

苷得率的影响均极显著，一次项A和交互项AC对花色苷得率的影响均为显著，其余项不显著。回归方程系数R2=0.9786， 模型p<0.0001 为极显著，失拟项p值0.6019>0.05 为不显著，说明模型与实测数据拟合程度高，实验误差小，可用于锦绣杜鹃花色苷提取工艺的预测和分析。

2.2.2 响应面交互作用分析

用 Design-Expert 软件对二次回归方程拟合，做出各实验因素两两交互作用的三维立体响应曲面图，考察在其中一个实验因素固定，中心值不变的情况下，其他两个实验因素的交互作用对花色苷得率的影响，结果见图 5至图7。

图5 乙醇积分数和超声温度对花色苷得率的交互影响

图6 液料比和乙醇体积分数对花色苷得率的交互影响

图7 液料比和超声温度对花色苷得率的交互影响

由图 5至图7可知，响应曲面图中的坡度越陡峭，表示相应的响应值对相关条件越为敏感[11，12]。每两个实验因素的交互作用均存在一个最高点，说明通过回归模型分析可以确定最佳提取条件，拟合模型具有良好的预测价值。经软件分析，最佳锦绣杜鹃花色苷的提取工艺条件：乙醇体积分数 65.81%，超声温度 55.54 ℃，液料比 106.21∶1，花色苷得率的理论值是 22.16 mL·(100g)-1。考虑到实践的操作，对提取工艺条件进行修正，取乙醇体积分数 65%，超声温度 55 ℃，液料比 105∶1。在此条件下，对实验进行验证，得到实验结果花色苷得率为 22.07 mL·(100g)-1，与预测值相近，说明响应面优化锦绣杜鹃花色苷提取工艺条件可行。

3 结论

(1)通过 Box-Behnken 组合设计，并采用响应面对实验结果进行分析，建立了锦绣杜鹃花色苷提取的二次回归方程模型，探讨了乙醇体积分数、超声温度及液料比对花色苷得率的影响。经软件分析，回归方程系数R2=0.9786，模型p<0.0001 为极显著，说明回归模型，实验误差小，合理可靠，可用于锦绣杜鹃花色苷提取工艺的预测和分析。

(2)经响应面法数据分析，并结合实践情况，对模型预测的最优提取工艺条件进行修正，得到锦绣杜鹃花色苷提取的最优条件为：乙醇体积分数 65%，超声温度 55 ℃，液料比 105∶1。在此条件下，进行验证，得到锦绣杜鹃花色苷得率为 22.07 mL·(100g)-1。