棠梨果中单宁的提取工艺优化

徐阳纯，王志强，李栩欣，许泽群，彭焱辉

广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学危害应急检测技术重点实验室（广州 510070）

棠梨异名杜梨、川梨、鹿梨、海棠梨，云南本土称为棠梨刺，也有个别地方唤野梨子或鸟梨[1-3]。棠梨是多年生落叶果树，棠梨分布广，常见于中国南部、北部、东北部和中部，长江中下游流域，如四川、广东、江西、云南，贵州等，属于蔷薇科梨属落叶乔木[4-6]。在云南地区，棠梨植株常见于海拔1 000～2 800 m的山林荒野间地梗边，自然成林，储量丰富，由于根系发达，棠梨树能够抵抗贫瘠，有良好的适应性和抗性，是防护林和沙荒地造林的珍贵物种[7-8]。

棠梨集食用、药用、材用和园林绿化于一身，综合利用价值非常高，树干可用于人工栽培嫁接繁殖梨的砧木，果实可作为食品加工制作主要原材料，其花还可用于观赏[9-12]。据研究，棠梨叶能够润肺止咳，清热解毒，疏肝和胃，缓急止泻[13]；棠梨花功效有降血脂和清理肠胃，是云南人民喜爱的食疗蔬菜之一[14]；棠梨果有降血糖、消除积食、通二便、敛肺涩肠功能，可治疗产后血瘀作痛。据《本草纲目》记载：味酸、甘、涩、寒；无毒[15]。烧熟食用，可治泄泻痢疾[16]。对棠梨果实营养成分及功效成分方面研究较少，其中：王志强等[17]对棠梨中矿物质元素进行分析，棠梨中含有丰富的P、K、Ca、Mn、Fe、B、Sr等矿物元素；赵小亮等[18]运用超声-微波协同萃取法并用蒽酮-硫酸比色法对棠梨果实多糖含量进行了分析；陈玉琴等[19]对棠梨中多糖及其流变性进行研究。对棠梨果实中其他营养成分及功效成分研究有待进一步开展。单宁，又称鞣质、单宁酸，是多元苯酚类衍生物，有多重功效，如抗病毒活性、收敛、抗肿瘤活性，并能与自由基发生反应，具有很强的抗氧化能力等[20-21]。试验用磷钼酸、钨酸钠为显示剂，采用分光光度法测定单宁含量，优化提取条件[22-24]，分析影响提取液保存条件，为棠梨果实的进一步开发利用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 主要材料与试剂

棠梨果（2019年10月，采自四川省阿坝藏族羌族自治州金川县梨园基地）。

单宁酸对照品（阿拉丁）；无水乙醇（广州化学试剂厂）；钨酸钠、钼酸钠、碳酸钠等（均为分析纯试剂）；水（均为实验室三级水）。

1.2 主要仪器与设备

BS224S电子天平（赛多利斯）；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）；电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；水浴恒温振荡器（上海汉诺仪器有限公司）；离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；WTS-200紫外可见分光光度计（上海慧多信息科技发展有限公司）；低温恒温槽（上海汉诺仪器有限公司）。

2 试验方法

单宁提取工艺：新鲜棠梨果子→去杂→清洗→棠梨果烘干→粉碎→过筛→提取→离心→单宁粗提液。

2.1 试剂溶液

2.1.1 乙醇溶液

25%，50%，75%和90%乙醇溶液。

2.1.2 钨酸钠-钼酸钠混合溶液

取50.0 g钨酸钠和12.5 g钼酸钠到烧杯中，加入350 mL三级水进行溶解，用移液管加入25 mL磷酸和50 mL盐酸到溶液中，搅拌均匀后接上回流装置回流，2 h后继续加入5.0 g硫酸铝，加入几滴溴水后继续加热15 min，冷却后定容到500 mL，过滤于棕色瓶中保存。

2.1.3 碳酸钠溶液（75 g/L）

称取75.0 g碳酸钠，加入三级水溶解，冷却至室温后定容到1 000 mL容量瓶中。

2.1.4 单宁酸对照品溶液（204 mg/L）

准确称取0.020 4 g单宁酸试剂到100 mL容量瓶中，加入三级水溶解后定容到刻度。

2.1.5 单宁酸对照品使用溶液吸取10.00 mL单宁酸对照品溶液，稀释到100 mL，摇匀待用，溶液的质量浓度为20.4 mg/L。

2.2 标准曲线

2.2.1 确定最大吸收波长

取1.0 mL 2.1.5小节所制使用溶液到10 mL比色管中，加入0.5 mL钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL碳酸钠溶液，用三级水定容到刻度上，摇匀静待显色反应，120 min后用1 cm石英比色皿，参比试剂空白，在400～900 nm光区中进行扫描，确定最大吸收波长700 nm。

2.2.2 标准曲线的制作

分别吸取0.10，0.15，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 mL 2.1.4小节对照品溶液于10 mL比色管中，分别加入0.5 mL钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL碳酸钠溶液，用三级水定容到刻度上，摇匀静待显色反应，120 min后用1 cm石英比色皿，参比试剂空白，在700 nm测定其吸光度。以单宁酸绝对量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2.3 单宁提取及含量测定

称取适量棠梨粉末到器皿中，按照一定的料液比加入相应比例和体积分数的乙醇溶液，恒温条件下提取一段时间后，将提取好的溶液转移至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，上清液过滤至100 mL管中定容备用。准确移取1.0 mL到10 mL比色管中，加入0.5 mL钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL碳酸钠溶液，用三级水定容到刻度上，摇匀静待显色反应，120 min后用1 cm石英比色皿，参比试剂空白，在700 nm波长下测吸光度，通过标准曲线得出试样测定液绝对量C，按照式（1）计算试样中单宁含量（mg/kg）。

单宁含量=C×k×V/（W×V1）/10 000 （1）式中：C为试样测定液中单宁量，μg；k为稀释倍数；V为定容体积，mL；W为取样量，g；V1为测定体积，mL。

2.4 单因素试验

2.4.1 固液比对单宁提取率的影响

分别准确称取3.30，2.50，2.00，1.67，1.25，1.00和0.50 g处理好的7份棠梨粉末到三角瓶中，各加入100 mL 50%乙醇溶液，盖上玻片，同时在50 ℃、32 kHz条件下进行超声，提取30 min后，将提取好的溶液转移至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，上清液过滤至100 mL管中定容备用。取1 mL提取液进行显色测定吸光度，分别比较不同固液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶80，1∶100和1∶200 g/mL）对单宁提取率的影响。

2.4.2 乙醇体积分数对单宁提取率的影响

分别称取约1.67 g处理好的棠梨粉末到6个三角瓶中，分别加入100 mL不同体积分数乙醇溶液，盖上玻片，同时在50 ℃、32 kHz条件下进行超声，提取30 min后，将提取好的溶液转移至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，上清液过滤至100 mL管中定容备用。取1 mL提取液进行显色测定吸光度，分别比较不同乙醇体积分数（0，25%，50%，70%，90%和100%）对单宁提取率的影响。

2.4.3 提取方式对单宁提取率的影响

分别称取约1.67 g处理好的棠梨粉末到6个三角瓶中，各加入100 mL 50%乙醇溶液，盖上玻片，2个放入提前设置好50 ℃的电热恒温水浴锅中，水浴浸提30 min，取出放置，冷却至室温；2个放进50 ℃超声波清洗仪，以32 kHz超声30 min，取出冷却；2个放进50℃水浴恒温振荡器，水平振荡30 min，取出。将提取好的溶液转移至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，上清液过滤至100 mL管中定容备用。取1 mL提取液进行显色测定吸光度，分别比较不同提取方式（浸提、超声、振荡）对单宁提取率的影响。

2.4.4 提取时间对单宁提取率的影响分别准确称取6份1.67 g处理好的棠梨粉末到三角瓶中，各加入100 mL 50%乙醇溶液，盖上玻片，同时在50 ℃、32 kHz条件下进行超声，提取不同时间后，将提取好的溶液转移至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，上清液过滤至100 mL管中定容备用。取1 mL提取液进行显色测定吸光度，分别比较不同提取时间（30，40，60，80，100和120 min）对单宁提取率的影响。

2.4.5 正交试验优化单宁提取条件

在单因素试验基础上，选择对棠梨中单宁提取率影响比较大的因素、较好的水平进行正交试验，得到提取棠梨中单宁的最优因素水平。

2.4.6 考察温度对棠梨果提取液稳定性的影响

移取10.0 mL棠梨果单宁提取液，分别置于不同温度（4，10，20，30，40，50和60 ℃）下于低温恒温槽恒温1 h，取出，待至室温显色，在700 nm下测其吸光度，考察温度对棠梨果提取液稳定性的影响。

2.4.7 考察时间对棠梨果提取液稳定性的影响

移取10.0 mL棠梨果单宁提取液，放置不同时间[0（现提），1，2，3，4，5和6 d]，显色后于700 nm测其吸光度，考察时间对棠梨果提取液稳定性的影响。

2.5 结果与分析

2.5.1 探究不同因素下对单宁提取的最佳条件

2.5.1.1 最优固液比

固液比对单宁提取率的影响见图1。

在一定范围内增高固液的比例对提高单宁提取率是有利的，主要原因是物料颗粒跟溶液之间保持合适的单宁浓度差有利于提取所需传质[16]。由图1可知：随着棠梨取样量的减少（固液比增大），棠梨果中单宁提取率逐渐增大，固液比1∶60 g/mL时，单宁提取率达到最大量0.85%；继续增大固液比例，单宁的提取率逐渐降低，主要原因可能为乙醇溶液比例过大时，棠梨果中其他成分溶出增加，降低单宁提取率。所以，选择1∶60 g/mL为最优固液比。

图1 固液比的影响

2.5.1.2 最优乙醇体积分数

溶液体积分数对单宁提取率的影响见图2。

提取过程中，溶液体积分数对单宁的提取率有较大影响，一般情况下相对较高体积分数的乙醇溶液更适用于单宁的提取，以此选择合适的乙醇体积分数可以提高单宁的提取率。由图2可知：乙醇体积分数在0～50%之间，单宁提取率随着乙醇体积分数增加而增多；乙醇体积分数处于50%时，单宁提取率为1.19%，达到最大；乙醇体积分数＞50%时，单宁提取率明显降低，可能原因是高体积分数的乙醇溶液使得一些醇溶性物质，如色素和某些亲脂性强的成分溶出增加，同单宁物质竞争结合，导致单宁的提取不升反降。因此。选择50%乙醇为最优溶液。

图2 溶液体积分数的影响

2.5.1.3 最优提取方式

提取方式对单宁提取率的影响见图3。

图3 提取方式的影响

在同样温度和时间下，3种提取方法以超声萃取效果最好，单宁提取率为1.21%，可能是因为超声提取中，超声振动产生的空化作用、扰动作用和搅拌作用等多重效用，使棠梨粉末中物质分子运动频率和速度增大，增强穿透溶剂的能力，加速单宁成分的溶出，从而使3种不同的提取方法出现一定差异。因此，选择超声萃取法为最优提取方式。

2.5.1.4 最优提取时间

提取时间对单宁提取率的影响见图4。

图4 提取时间的影响

提取时间小于100 min时，随着提取时间增加，单宁萃取率逐步增多，原因是提取时间过短，则单宁萃取不完全，导致单宁提取率低；当提取时间增长，破壁阻力逐渐减弱，破除细胞壁的效果增强，单宁提取率上升；提取达到100 min时，单宁含量达到最大值，为1.27%；提取超过100 min，单宁提取率无明显变化，说明超声100 min时棠梨中单宁基本萃取完全。因此，选择100 min为最优提取时间。

2.5.2 正交试验结果

在单因素试验基础上，以对棠梨中单宁提取率影响较大的因素和较好的条件作为因素水平进行正交试验，优化出棠梨单宁提取的最佳条件，结果见表1。

表1 正交试验结果

在正交试验范围内，棠梨单宁的最优提取条件组合为A2B2C3D3，即固液比1∶60 g/mL、乙醇溶液体积分数50%、超声提取方式、提取时间120 min。4个因素对单宁提取率的影响顺序为提取方式（C）＞乙醇溶液浓度（B）＞固液比（A）＞提取时间（D）。在优化得到的棠梨果单宁提取最佳条件下，按照2.3小节提取棠梨果单宁，制作平行试样3份，棠梨果单宁平均提取率为1.44%，SRSD为4.0%，回收率为83%，说明优化的提取棠梨果单宁条件合理、稳定、可行，可作为棠梨果单宁的提取最佳条件。

2.5.3 棠梨果单宁稳定性结果分析

2.5.3.1 温度对棠梨果提取液稳定性的影响

按照2.4.5小节得到吸光度与温度的关系，结果见图5。

图5 温度对稳定性的影响

在4～30 ℃范围内，随着温度的升高，棠梨果单宁液的吸光度变化不大，温度高于30 ℃，棠梨单宁液的吸光度逐渐下降，说明棠梨单宁对高温微敏感。所以，提取后的单宁液在30 ℃以下稳定性较好，保存时最好低温保存。

2.5.3.2 时间对棠梨果提取液稳定性的影响

按照2.4.6小节，得到吸光度与时间的关系，结果见图6。

图6 时间对稳定性的影响

在6 d范围内，吸光度变化小，但随着时间延长，棠梨果单宁液的吸光度缓慢下降，但总体稳定性较好。

3 结论

探究棠梨中单宁提取的最优条件以及棠梨果提取液稳定性。结果表明，棠梨果中单宁提取的最优条件：固液比1∶60 g/mL，溶液采用50%乙醇，提取方式采用超声萃取法，提取时间120 min；单宁提取量的影响顺序为提取方式（C）＞乙醇溶液体积分数（B）＞固液比（A）＞提取时间（D）。提取后的单宁液在30 ℃以下稳定性较好，提取液保存环境应低于30 ℃。