加味玉屏风散滴鼻剂治疗变应性鼻炎药效学研究

卢烨 冯炜

变应性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）是指当机体暴露于变应原后由IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性，主要症状为鼻痒、鼻塞、喷嚏、清水样涕和眼痒等症状。国内外大量流行病学调查显示，近年来AR的患病率明显上升，给患者生活质量和社会经济带来严重影响。鼻喷激素，作为变应性鼻炎治疗的一线用药[1，2]，在临床中取得了良好的治疗效果。但长期使用仍有潜在的副作用，如鼻干、头痛和鼻出血[3]。并且，临床实践中，仍有部分患者存在“激素恐惧”导致了临床用药的依从性差[4]，使得患者的治疗效果欠佳。

本科室在耳鼻喉科经典名方《玉屏风散》的基础上结合多年临床经验并考虑鼻腔用药的特殊性及药物对鼻腔黏膜的刺激性进行加减，形成了加味玉屏风散组方（由黄芪、白术、防风、苍耳子、白芷、辛夷、薄荷组成），在玉屏风散益气固表的基础上加强了散邪通窍之功用。并且在常规口服的用法上改为局部用药，提高药物使用的安全性，减少全身用药潜在的副作用。前期临床观察证实了其确切疗效，本试验通过动物模型研究加味玉屏风散对AR豚鼠鼻腔中炎性细胞及血清中组胺、IgE及TNF-α的药效学影响，以揭示其潜在的免疫调节机制。

材料与方法

1 实验材料

1.1 动物

豚鼠来源于湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018；实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2013-0069。豚鼠饲养在SPF环境中，自由饮水和自由进食。

1.2 仪器与试剂

加味玉屏风散（黄芪、白术、防风、苍耳子、白芷、辛夷、薄荷）由四川新绿药公司提供颗粒剂。针对方中各药味的药理作用，分别采用提取挥发油、水提和醇提工艺，采用正交试验法筛选提取工艺条件。提取物室温干燥保存备用，实验时以生理盐水配成饱和溶液。

氢氧化铝（30mg/ml）（Sigma no.239186-25G）混悬液，OVA（0.3 mg/ml）（Sigma no.A5503-1G），染色湿盒（南京建成no.DO10），组胺ELISA试剂盒（Abcam no.ab213975），TNFα ELISA试剂盒（联科生物no.EK2822/2-96T），IgE ELISA试剂盒（联科生物no.EK2752-96T），常用试剂均为分析纯：甲苯胺蓝染液，氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、无水乙醇、二甲苯、EDTA-2Na、中性树胶均购于上海国药集团。

2 实验方法

2.1 AR模型制备

参考国内外相关文献[5-8]的方法并加以改善，基础致敏：豚鼠随机分为正常对照组（10只）和模型组（30只）。模型组豚鼠以腹腔注射致敏，鼻部滴注激发，建立变应性鼻炎模型。将OVA 0.3mg、氢氧化铝30mg溶于0.9%氯化钠溶液1ml。在第1、3、5、7、9、11、13d，每只豚鼠腹腔注射1ml。然后采用OVA皮内注射法（小鼠背部皮内注射25ul的200ug/mlOVA无菌注射用水）鉴定豚鼠致敏是否成功（红斑和皮丘直径大于1.0mm为致敏成功）。加强免疫阶段：致敏成功的豚鼠休息7天后，从第21～27d，模型组豚鼠每天鼻内滴注无菌生理盐水稀释的OVA（每个鼻孔20μl，50mg/ml）。正常对照组豚鼠以0.9%氯化钠溶液注射及鼻内滴注，方法与次数同模型组。

2.2 分组与给药

将豚鼠随机分为四组：正常对照组、模型组、加味玉屏风散组、糠酸莫米松组，每组10只。局部末次给药后评价模型制备成功，开始药物干预。正常对照组和模型组以相同容量生理盐水滴鼻，加味玉屏风散组以加味玉屏风散提取物饱和溶液用微量加样器鼻腔给药。阳性对照组以糠酸莫米松鼻喷雾剂（0.5μg/μl）用微量加样器鼻腔给药。

加味玉屏风散滴鼻剂制备方法，选用黄芪、白术、防风、苍耳子、白芷、辛夷、薄荷中药颗粒剂（四川新绿药）按比例混合，溶于0.9%氯化钠溶液，制成饱和溶液。微量加样器鼻腔给药。各组均用80μl滴鼻，2次/d，连续14d。豚鼠正常体温38.6（37.8～39.5）℃。给药前，中药保持在38.6（37.8～39.5）℃左右。

2.3 行为学评价

造模开始后观察豚鼠精神、皮毛、饮食情况、鼻部症状等，末次激发后，每只动物观察30min，根据挠鼻次数、喷嚏个数、流涕程度评分[4]。鼻痒，轻擦鼻几次，1分；抓挠鼻、面不止，到处摩擦，2分；喷嚏，1～3个，1分；4～10个，2分；11个以上，3分；清涕，流至鼻前孔，1分；超过鼻前孔，2分；流涕满面，3分。各症状记分叠加，总分大于5分提示造模成功。

2.4 动物处理及标本采集

各组动物均于末次激发后24h取材，称重，按60mg/kg计量换算用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。股动脉取血，收集血清，ELISA（组胺ELISA试剂盒：Abcam no.ab213975，TNFα ELISA试剂盒：联科生物no.EK2822/2-96T，IgE ELISA试剂盒：联科生物no.EK2752-96T）检测血清中组胺、TNF-α、IgE水平。

断头处死豚鼠迅速打开鼻背，暴露鼻中隔及两侧鼻腔。将鼻中隔中段剪下，剥离双侧黏膜。一侧黏膜放入4%甲醛溶液中固定，石蜡切片，H&E染色，光镜下观察鼻黏膜组织形态学，在高倍显微镜下观察嗜酸性粒细胞。另一侧黏膜放入4%甲醛溶液中固定，甲苯胺蓝染色，在高倍显微镜下观察肥大细胞并在400x视野下，选取不同的10个镜下视野行肥大细胞计数，并取其均值。

3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间差异用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，不服从正态分布或方差不齐的采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 豚鼠行为学评价

末次激发后观察30min， 模型组30只小鼠的挠鼻、喷嚏及流涕总积分均大于5分，正常对照组差异有统计学意义，证明豚鼠AR模型制备成功（见图1）。

图1 对照组和造模豚鼠鼻部症状总评分比较（****P＜0.0001，NS:no significant，差异无统计学意义）

2 豚鼠鼻腔嗜酸粒细胞

我们对各组豚鼠的鼻腔进行H&E染色，观察鼻黏膜组织形态学，在高倍显微镜下可见：相对于对照组，OVA模型组豚鼠鼻腔中嗜酸性细胞的数量经过14天的治疗后，加味玉屏风散组及糠酸莫米松组总评分较模型对照组明显减少（P＜0.0001＝，但两治疗组之间的鼻炎症状评分改善情况没有统计学差异（P=0.313）），见图2。显著增加（红色箭头）。说明豚鼠变应性鼻炎模型成功建立。与模型组相比，加味玉屏风散组和糠酸莫米松组的鼻分泌物中嗜酸性细胞的数量显著减少，见图3。

图2 各组豚鼠不同的治疗后鼻部症状总评分的改善比较（*****P＜0.0001，NS：no significant，差异无统计学意义）

图3 各组鼻黏膜组织H&E染色图片（红色箭头表示嗜酸性粒细胞）

3 豚鼠鼻腔肥大细胞

模型对照组肥大细胞数量较正常对照组有显著升高，较模型对照组有显著下降，其中加味玉屏风散组与糠酸莫米松组无统计学差异，其余各组差异具有统计学意义。400倍视野下肥大细胞计数，模型组的每高倍视野下肥大细胞个数为62.33±11.530，明显高于对照组（6.40±2.947，P＜0.05）。加味玉屏风散组与糠酸莫米松组肥大细胞计数分别为23.13±4.838和19±5.182，显着低于模型（P＜0.05）见表1。模型组的肥大细胞数量明显高于对照组，而加味玉屏风散组与糠酸莫米松组则较低（图4红色箭头示肥大细胞）。

图4 各组鼻黏膜组织甲苯胺蓝染色肥大细胞（红色箭头）

表1 各组肥大细胞数量统计结果

4 血清IgE、组胺、TNF-α

模型组的血清OVA特异性IgE水平显着高于对照组。加味玉屏风散组及糠酸莫米松组均较模型组下降，（图5A所示，P均<0.0001）。模型组中的组胺水平明显高于对照组（19.79±1.295 vs 5.854±0.270，P<0.0001），与症状评分和IgE水平的趋势一致。加味玉屏风散组与糠酸莫米松组的组胺水平明显低于模型组（均值分别为-7.812±1.458和-7.361±1.461），但两者之间的组胺水平无显着差异（P=0.641，图5B）。各组豚鼠血清TNF-α含量差异有统计学意义（P<0.05），模型组含量较正常对照组明显升高（P<0.05），加味玉屏风散组及糠酸莫米松组含量均较模型对照组降低，差异有统计学意义（P<0.05），加味玉屏风散组及糠酸莫米松组差异无统计学意义（图5C）。

图5 各组豚鼠血清的IgE、组胺、TNF-α比较（A：组胺；B：IgE；C：TNF-α）

讨论

过敏性疾病现在已经成为全球关注的公共卫生问题，变应性鼻炎因其常与支气管哮喘、过敏性结膜炎、鼻窦炎、鼻息肉等合并存在，引起了越来越多的关注。尽管临床治疗方法有多种选择，但仍有部分患者的治疗效果欠佳。根据变应性鼻炎中国指南[1]，中医药治疗在改善AR症状及预防复发等方面有其优势。且相关研究在不同方面证实了中药，尤其是玉屏风散在免疫调节治疗的作用。加味玉屏风散滴鼻剂经过临床验证，在改善症状，预防复发方面有明显效果。本研究基于动物实验，进一步研究了加味玉屏风散的药效及其潜在机制。

中医学中，AR属“鼻鼽”范畴，为风寒入侵致鼻窍壅塞，或肺气虚，不能卫外，或气虚不摄为涕。王琦等[9]认为，过敏体质为中医“特禀质”范畴，属先天禀赋不足，二者治法皆以扶正祛邪为主。

玉屏风散出自元朱丹溪《丹溪心法》，具有益气固表止汗之功效，文献记载因其功用有似御风屏障，珍贵如玉，得名玉屏风散，能够提高机体的卫外防御功能。现代中医学中玉屏风散是AR及其他过敏性疾患临床常用方剂，大量文献[10-12]证明玉屏风散无论是口服汤药或是中成药均有良好疗效。研究表明，口服玉屏风散可抑制变应性鼻炎患者肥大细胞活性[11]，提高细胞内cAMP含量和降低cGMP含量及降低血清IL-6水平[12]。本研究中的加味玉屏风散是在玉屏风散的基础上加以苍耳子、辛夷、白芷、薄荷，以加强组方散风通鼻窍之功效。方中黄芪可大补脾肺之气，外可固表止汗；白术健脾益气，助黄芪以加强益气固表之力，共为君药；两药合用，使气旺表实，则汗不外泄，外邪亦难内侵。苍耳子疏风散湿，上通脑顶，外达皮肤；辛夷通九窍，散风热，能助胃中清阳上行头脑；白芷主手足阳明经，上行头面，通窍表汗，除湿散风，共为臣药；黄芪、白术味甘性缓，不能速达于表，故佐以防风则固表而不留邪、祛风而不伤正；苍耳子、辛夷、白芷佐以薄荷泄肺疏肝，清利头目。古代文献中可见丰富的滴鼻、塞鼻、吹鼻等外治法记载，《千金方》中鼻科篇外治方40首占总数82.7%，说明自古以来中药外治在鼻科疾病的治疗中占了非常重要的地位，本研究将治疗变应性鼻炎的经典名方应用于中药外治法，在临床上取得了良好的疗效。

打喷嚏、鼻痒、鼻塞、流清涕是AR患者的典型症状，其严重影响生活质量，因此，本研究重点观察了豚鼠鼻部行为学表现。结果发现加味玉屏风散滴鼻剂用药14天后可明显改善豚鼠鼻部症状评分，且与糠酸莫米松鼻喷用药改善效果无组间差异，证明加味玉屏风散滴鼻剂在改善喷嚏、鼻痒、流涕症状方面与目前一线用药鼻用糖皮质激素效果相当。

肥大细胞和嗜酸粒细胞分别是AR速发相和迟发相反应的主要炎性细胞，在变应性鼻炎的发生发展中起重要作用。嗜酸性粒细胞能够损坏呼吸道黏膜及纤毛，促使肥大细胞中的组胺等介质游离，进而促进变态反应的发展[13]。本实验发现，加味玉屏风散滴鼻剂可以减少鼻腔黏膜中的嗜酸粒细胞和肥大细胞数目，从而控制AR的发展。

IgE是引起速发相超敏反应的主要抗体，血清IgE水平作为过敏性疾病的标志性指标，也是诊断过敏性疾病及评价药物疗效的重要指标之一[14]。本研究显示，加味玉屏风散滴鼻剂可有效降低豚鼠血清IgE指标，这可能是由于促使浆细胞从IgA或其他形式转变为IgE的炎性细胞因子释放减少所致。温爱平等[15]及其团队发现发现玉屏风散可增强患者的身体素质，改善了免疫功能，并促进了IgA，IgG和单核巨噬细胞的分泌[15]。本研究中，血清中IgE水平降低可通过减少致敏IgE与嗜酸性粒细胞、肥大细胞的结合，从而减少了肥大细胞脱颗粒，进而减少组胺的释放。

既往研究表明TNF-α在过敏性疾病的发病中发挥了重要作用[16，17]，其主要原因在于TNF-α使IL-8的分泌增加，而IL-8又促进了Th2细胞合成IgE。另外TNF-α可以促使淋巴细胞、中性粒细胞、嗜碱粒细胞的趋化、聚集，释放活化产物，导致组织损伤。此外，TNF-α还可以直接刺激B细胞活化，产生大量的IgE。本研究中，加味玉屏风散滴鼻剂明显降低血清中TNF-α水平，这与李莉等[18]在过敏性皮炎的小鼠模型中试验结果相一致，其研究表明，加味玉屏风可通过下调TNF-α表达抑制小鼠皮肤的炎症。

综上所述，本研究基于行为学，鼻黏膜病理学，血清学指标初步评价了加味玉屏风散治疗AR的药效。结果表明，加味玉屏风散滴鼻剂抑制鼻黏膜中嗜酸性粒细胞和肥大细胞的迁移以及脱颗粒，同时下调了TNF-α的表达。它重新平衡了T细胞释放的细胞因子，并减少了B细胞的OVA特异性IgE分泌。加味玉屏风散以黄芪为君药配伍防风、苍耳子、辛夷、薄荷等药，以达到扶正祛邪之功效，研究表明玉屏风散有明显的免疫调节功效[19]，辛夷[20]挥发油及玉屏风散[21-23]可以调整Th1/Th2平衡，缓解鼻黏膜炎症，防风[24]挥发油可以发挥抗组胺作用，防风多糖[25]可抑制过敏反应。此外，本实验中所有的试验小鼠均无不良事件发生。因此，加味玉屏风散滴鼻剂中七味药物，不仅配伍精当，契合AR的核心病机，且可在抗原提呈、T细胞增殖活化、IgE分泌以及组胺等炎症介质释放等过敏反应发生的各个环节起调控作用，另外，药物作用于局部，起效迅速，安全有效，优势显而易见，具有很好的临床应用前景。