PD-1/PD-L1信号通路在肝移植免疫应答中的作用

陆晶 徐军明

我国是原发性肝癌（肝癌）大国，每年新发肝癌例数达50万以上。肝癌是我国肝移植的主要适应证之一，占成人肝移植原发病比例高达45.3%[1]，肝癌肝移植术后复发仍是影响我国成人肝移植受者长期生存率的主要因素，预防及治疗肝癌肝移植术后复发是一项有待临床研究的重大课题。

程序性细胞死亡蛋白 1（programmed cell death protein 1，PD-1）属于CD28家族。PD-1是一种相对分子质量为50～55 的Ⅰ型跨膜糖蛋白受体，包括N端胞外结合域、跨膜结合域和C端胞浆结合域3部分，胞浆结合域含2个信号传导模体，包括1个免疫受体酪氨酸抑制基序和1个免疫受体酪氨酸交换基序。PD-1主要表达于活性T细胞、B细胞、骨髓细胞和自然杀伤细胞[2]。PD-1的配体包括程序性细胞死亡蛋 白 配 体 1（programmed cell death protein-ligand 1，PD-L1）（又称为B7-H1或CD274）和程序性细胞死亡蛋白配体 2（programmed cell death protein-ligand 2，PD-L2）（又称为B7-DC或CD273），PD-L1表达于静息T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞，而PD-L2表达于树突状细胞和巨噬细胞[3]。 PD-L1通过与受体结合并激活增殖和生存信号通路，在癌细胞中扮演致瘤因子的角色[4]。

PD-1/PD-L1通路促进调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的增殖并抑制效应性T细胞相关免疫应答。该通路不仅在肿瘤免疫中起重要作用，在器官移植免疫中同样起重要作用。近年来，以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）成为治疗晚期肝癌病人的重要手段之一，但能否用于肝移植受者仍存在较大的争议。本文就PD-1/PD-L1通路在肝移植免疫耐受中作用机制以及ICI在肝癌肝移植术后复发受者中的应用做一综述。

1 PD-1/PD-L1在移植肝组织的表达

在小鼠同种异体肝移植模型中，C57BL/6小鼠肝移植术后肝组织中PD-L1的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平明显增加，于 6 h达高峰。在肝移植术前小鼠肝组织中，PD-L1在CD11c+树突状细胞和CD31+肝窦内皮细胞上表达，但不在肝细胞上表达，肝移植术后PD-L1在上述3类细胞的表达水平均增加。用PD-L1敲除的小鼠供肝行肝移植会加重术后移植肝损伤，且浸润移植肝的淋巴细胞数量明显增多，尤其是CD8+T细胞，受体血液中CD8+T细胞比例升高且凋亡减少，炎症因子如白细胞介素（interleukin，IL）-6、细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）-1等水平明显上升[5]。这提示PD-1/PD-L1通路在小鼠肝移植免疫应答中起到降低术后免疫反应、保护肝脏免受免疫损伤的重要作用[5]。

在小鼠肝移植免疫耐受模型中，C57BL/6小鼠肝脏移植到C3H小鼠体内，超过85%的小鼠存活时间超过100 d。敲除PD-L1基因的C57BL/6小鼠肝脏移植到C3H小鼠体内，7 d内即发生排斥反应，移植肝内出现大量浸润性T细胞，且CD8+T细胞、CD4+T细胞凋亡水平较低。PD-1抑制剂处理组的同种异体肝移植受体小鼠在29 d内发生排斥反应，提示抑制PD-1/PD-L1通路会增强受体对供体的免疫应答，导致排斥反应。肝移植术后行PD-L1抑制剂处理的受体小鼠表现出高炎症反应，术后8 d后出现静脉炎、胆管上皮内淋巴细胞浸润、肝脏充血和出血性损伤。与术后5 d相比，术后8 d移植肝组织内CD8+T细胞浸润增加，相关基因（如颗粒酶B、FasL、穿孔素）和炎症因子（如骨桥蛋白、诱导型一氧化氮合酶）表达增加[6]。

临床上，供肝再灌注后PD-L1的表达上调，尤其在门静脉区域。PD-L1在肝移植术前供肝活组织检查（活检）组织中低表达或不表达，在早期和晚期的肝移植排斥反应活检组织中，胆管上皮细胞、浸润性T细胞和肝窦血管内皮细胞的PD-L1表达水平均明显升高，但肝细胞的PD-L1表达水平没有明显变化[7]。与肝移植术后免疫耐受的受者相比，发生急性排斥反应（acute rejection，AR）受者外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量明显下降，大量CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润肝脏，同时CD8+T细胞和CD4+T细胞上的CD152和PD-1表达也减少。发生AR的受者其CD152和PD-1阳性CD8+T细胞上的颗粒酶B和穿孔素表达也明显增加。对发生AR受者的移植肝进行活检，结果发现PD-L1在门静脉和小叶区的表达增加，PD-L1分别表达于门静脉区域胆管上皮细胞、浸润T细胞和小叶区肝细胞、肝窦内皮细胞。胆管上皮细胞、浸润性T细胞和肝窦内皮细胞的PD-L1存在于细胞表面和细胞质内，而肝细胞的PD-L1仅存在于细胞质内。目前临床报道显示，肝移植受者发生AR时，肝组织内PD-1/PD-L1表达上调，可能是机体的一种负反馈保护机制[8]。

2 PD-1/PD-L1诱导移植免疫耐受的机制

研究表明，PD-1/PD-L1在诱导移植免疫耐受和促进移植物存活中起到了重要的作用，其作用机制可能包括以下几个方面。

2.1 抑制效应性T细胞并诱导其凋亡

PD-1与PD-L1结合后，阻断磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt） /哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ mammalian target of rapamycin， mTOR）和 Ras/丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（Ras/mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated protein kinase，Ras/MAPK/ ERK）等通路的激活，导致初始T细胞功能失活，抑制效应性T细胞的分化并降低其功能，阻断PI3K激活会抑制IL-2产生，导致CD8+T细胞、CD4+T细胞失能[3,9-10]。PD-L1可与B7-1结合，阻断CD28-B7共刺激通路，抑制T细胞的功能[11-12]。在干扰素（interferon，IFN）-γ刺激下，肝星状细胞表达高水平的PD-L1，诱导活化T细胞凋亡[6]。PD-1/PD-L1通路可通过PI3K/Akt/mTOR通路、Ras/MAPK/ERK通路、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-9和Caspase-3通路诱导CD4+T细胞、CD8+T细胞凋亡[10]。结合PD-1和B7-1的PD-L1激动剂能有效增强PD-1/PD-L1介导的T细胞活化，从而诱导其凋亡；但在PD-1缺失的情况下，PD-L1激动剂可增强T细胞的增殖能力和免疫功能[12]。

2.2 诱导Treg生成

PD-1/PD-L1可通过Notch通路诱导Treg产生。天冬酰胺内肽酶（asparaginyl endopeptidase，AEP）可裂解Foxp3，通过PD-1/PD-L1通路下调AEP表达可维持Foxp3的稳定，导致诱导型Treg（inducible Treg，iTreg）和 Foxp3+辅助性T 细胞 1（helper T cell 1，Th1）（Tbet+iTregPDL1）的形成。PD-1/PD-L1通路还可将Th1转变为Treg，在转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β存 在 时，PD-1/PD-L1通 路优先将初始T细胞转变为Treg尤其是iTreg[9,13-14]。PD-1抑制剂亦可通过PD-1/PD-L1通路阻断Treg 生成并终止免疫耐受[15]。

2.3 其他可能原因

研究显示，肝移植术后受体小鼠肝脏内大量表达受体主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ的树突状细胞替代了表达供体MHC Ⅰ的树突状细胞，这些细胞高表达PD-L1。移植肝树突状细胞对初始T细胞刺激能力减弱，显著抑制受体T细胞应答，促进CD8+T细胞衰竭或坏死，从而诱导移植免疫耐受。在小鼠肝移植排斥反应模型中，排斥反应组树突状细胞数量少于未发生排斥反应组，且树突状细胞表面PD-L1表达显著减少[16]。

3 PD-1/PD-L1抑制剂在肝癌肝移植中的临床应用

近年来，ICI为恶性肿瘤病人带来新的希望，但对于器官移植受者，存在导致AR的风险，限制了该类药物在移植受者中的应用。常见的ICI包括PD-1抑制剂帕博利珠单抗（pembrolizumab）和纳武单抗（nivolumab），PD-L1抑制剂阿替利珠单抗（atezolizumab）和度伐单抗（durvalumab）等。

肝癌肝移植术后复发受者应用ICI时，为了增强抗肿瘤效果，免疫抑制剂的用量通常会减少一半，这进一步增加了排斥反应发生风险[17]。研究发现，接受ICI治疗的移植受者中45%（13/29）发生了AR，其中11例肝移植受者中37%发生AR[18]。另一项研究中，10例肝移植受者接受PD-1抑制剂治疗，30%（3/10）的受者发生AR[19]。肝移植术后使用ICI的不良反应可表现为腹痛、高热、黄疸、腹泻以及各类肝酶异常。移植物丢失是使用ICI的受者非常严重的并发症，在用药过程中发生无法逆转的暴发性肝衰竭，从而导致移植物失功[18-19]。

但也有研究报道，肝移植受者应用PD-1抑制剂后取得较好疗效，同时未发生AR。据Qiu等[19]报道，1例54岁的男性肝癌病人行肝移植手术，术后肝癌复发并转移，采用卡瑞利珠单抗、西罗莫司（雷帕霉素）和索拉非尼治疗后，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平显著降低，肺部转移灶和淋巴结直径缩小；6年后CT显示肝癌新转移灶快速发展，原发肿块增大，但并未出现AR，病人最终死于肿瘤进展。Varkaris等[20]也报道了1例肝移植受者使用帕博利珠单抗治疗复发性肝癌，受者肝功能无明显变化，治疗后未出现AR，最后于术后9年死于肿瘤进展，作者认为对于使用PD-1抑制剂的受者，糖皮质激素和雷帕霉素合用可预防AR。在上述2项报道中，肝癌肝移植术后复发的受者均使用了PD-1抑制剂并获得生存期的延长，并且未出现AR。

Nordness等[21]的研究报道，1例肝癌肝切除术后复发病人经过近2年的纳武单抗治疗，AFP从2 500 μg/L降至5.5 μg/L，且影像学提示肿瘤显著缩小，符合米兰标准，随后进行了肝移植，但在术后6 d出现AR，并在术后10 d死亡。Tabrizian等[22]的研究报道了9例肝癌肝移植受者，术前均使用纳武单抗治疗，在平均16个月的随访中，8例受者未发生AR，1例受者由于使用低剂量他克莫司发生轻微AR，在增加药物剂量后恢复，均未发现肝癌复发。崔春晓等[23]的研究也提示肝癌肝移植术前使用PD-1抑制剂的受者，术后排斥反应的发生率未见明显增加。肝癌病人是否可以使用PD-1抑制剂进行抗肿瘤治疗以获得降期从而符合肝移植手术指征，以及肝移植术前使用过PD-1抑制剂的受者术后AR的发生率是否会增加，这些问题都需要进一步的深入研究。

Munker等[24]报道在ICI治疗开始后，3例发生AR受者的移植肝活检组织PD-L1染色为阳性，而从未发生排斥反应的4例受者均为阴性，提示移植肝PD-L1的表达水平或许与AR的发生有关，移植肝活检检测PD-1/PD-L1对ICI的使用具有指导价值，即是否使用PD-1/PD-L1抑制剂或细胞毒T淋巴细胞相关抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen，CTLA）-4抑制剂，以及是否联合糖皮质激素。

ICI联合放射治疗（放疗）可以减少ICI的用量，从而可能降低药物不良反应。早期停用ICI的部分受者仍存在抗肿瘤反应，提示低剂量药物也许能在不引起排斥反应的同时起到抗肿瘤作用。放疗可触发肿瘤衍生抗原的释放，在辐射区域外也会引发抗肿瘤免疫反应，被称为闭关效应，ICI治疗可增强该效应。这种类似疫苗的机制可以缩短ICI的使用时间，而获得与长时间ICI治疗的疗效相同但排斥反应发生率低的效果[25]。

此外，ICI与mTOR抑制剂、BARF/丝裂原活化 蛋 白 激 酶 激 酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）抑制剂和布鲁顿氏酪氨酸蛋白激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）抑制剂的联合疗法也在研究当中。PD-1抑制剂治疗时将他克莫司换为mTOR抑制剂如雷帕霉素，再联合低剂量糖皮质激素可降低排斥反应发生风险[25-27]。

对于应用ICI治疗后出现的AR，据早期研究报道70%～80%可通过大剂量糖皮质激素缓解，但缺乏足够证据。血浆置换可用于肝移植术后急性体液性排斥反应，从循环中去除ICI，对于ICI治疗引起的AR或许有潜在帮助。总的来说，针对应用ICI治疗后出现的AR，有效的治疗方法尚待研究[18]。在AR预防方面，现有证据表明肝移植和ICI治疗的间隔时间越长，AR的发生率越低，该间隔时间可通过合理使用ICI和免疫抑制剂而延长[28]。

4 小 结

PD-1/PD-L1通过多种机制参与肝移植免疫耐受。PD-1/PD-L1抑制剂已成为治疗晚期肝癌的手段之一，但对于肝癌肝移植术后复发受者，PD-1/PD-L1抑制剂虽然可以延长受者的生存期，但存在诱发致命性AR的风险。迄今，PD-1/PD-L1通路在肝移植免疫耐受中的具体作用机制仍有待研究，对于肝癌肝移植术后复发受者，如何提高ICI用药的安全性仍有待进一步研究。