胰岛类器官基础应用的研究现状与展望

吴玲玲 蒋鹏 武桢 李万里 杨玉伟 高宏君

类器官（organoid）是指利用干细胞的全能性，将其在体外进行培养，使其不断进行自我更新和自我组织，形成在结构和功能上与原始器官相似的组织[1-4]。目前常用的是人类多能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC），包括胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），它们具有分化为机体中几乎所有细胞类型的潜能[5-9]。其中胰岛类器官可解决器官移植供者来源稀少的问题，是治疗糖尿病的潜在方法，也是类器官领域研究的热点。本文对胰岛类器官的起源与发展、胰岛类器官的基础应用进行综述。

1 胰岛类器官的起源与发展

1978年，Goodman等[10]首次培养出鸡血管壁类器官。经过40多年的发展，类器官的研究技术日益趋向成熟，已成功培养出肝、脑、肾、胰、肠等类器官[11-15]。胰岛类器官最早由Montesano等[16]于1983年通过分离大鼠胰腺分泌细胞，在体外重新结合形成。2018年，Candiello等[17]证实可通过诱导人类ESC（human ESC，hESC）产生分泌胰岛素的胰岛样细胞。目前胰岛类器官的研究取得了长足的进步，主要的基础应用包括疾病治疗和疾病建模等。

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。国际糖尿病联盟在最新发布的糖尿病全球管理指南中指出，2040年世界糖尿病人口数将达到6.42亿[18]。由于β细胞功能不全是糖尿病的共同特征之一，所以从可再生资源中找到可替代的功能性β细胞可能是治疗糖尿病的有效方法[19-20]。胰岛移植可用于替代1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）中的β细胞功能，但由于缺乏供者器官，用于细胞替代治疗的可移植β细胞来源极为有限[21-22]。目前，越来越多的科学家使用hESC和iPSC作为β细胞的来源，许多研究小组已研究出通过体外培养胰岛样细胞来模拟胰腺发育的方案[23-25]。

2 胰岛类器官的基础应用

2.1 来源于hPSC的胰岛类器官

2014年，Pagliuca等[26]将hPSC衍生的β细胞移植到糖尿病小鼠的肾囊下，发现移植了β细胞的小鼠空腹血糖平均值＜11.1 mmol/L，而对照组即未移植β细胞的糖尿病小鼠血糖水平逐渐升高，达到33.3 mmol/L，表明hPSC衍生的β细胞可降低糖尿病小鼠的血糖。2015年，Russ等[27]用hPSC衍生出胰十二指肠同源盒 1（pancreatic and duodenal homeobox 1，Pdx1）+和 Pdx1+/NK6 同 源 盒 1（NK6 homeobox 1，NKX6.1）+的胰腺祖细胞群，其在体外可产生葡萄糖反应性β样细胞。为了进一步研究hPSC衍生的β样细胞在体内的功能特性，研究者将其移植到链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病小鼠的肾囊，发现与对照组小鼠相比，移植组小鼠的血糖水平下降，表明hPSC衍生的β样细胞对糖尿病小鼠的短期血糖控制具有一定的效果，但随着时间的增加，糖尿病小鼠的血糖水平逐渐上升。2020年，Hogrebe等[28]在体外将hPSC诱导出能产生胰岛素的β样细胞，其功能特性与胰岛β细胞相似，能显著改善体内和体外功能，将其通过肾囊注射的方式移植到糖尿病小鼠体内，术后每周监测小鼠血糖水平，发现其可维持正常血糖水平至少36周。

2.2 来源于hESC的胰岛类器官

2007年，Jiang等[29]将hESC诱导成能产生胰岛素的β细胞，发现其可表达如Pdx1、胰岛素、C肽等胰岛特定基因，将这些β细胞移植到糖尿病裸鼠后，30%的裸鼠表现出明显的血糖水平下降，且可维持6周以上。2015年，Shim等[30]将hESC诱导成胰腺内分泌细胞，随后使用STZ诱导雄性裸鼠建立糖尿病模型（血糖水平≥22.2 mmol/L），将胰腺内分泌细胞通过肾囊注射的方式移植到裸鼠体内，术后50 d内裸鼠血糖水平显著降低，术后100 d去除移植物后血糖水平迅速升高，表明来源于hESC的胰腺内分泌细胞可改善糖尿病裸鼠的血糖水平。2016年，Kim等[31]将hESC诱导出能表达胰腺内分泌激素的内分泌细胞，1 d后内分泌细胞自发形成内分泌细胞簇（endocrine cell cluster，ECC），其中与β细胞相关基因的转录水平和胰岛素分泌增加。随后，研究者将ECC移植到STZ诱导的非肥胖性糖尿病（nonobese diabetes，NOD）/重症联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency，SCID）糖尿病小鼠附睾脂肪垫，发现假手术组小鼠在停止胰岛素治疗后3 d因高血糖死亡，而ECC移植小鼠的血糖水平在术后3 d内迅速下降至正常范围，且存活超过40 d。表明hESC来源的胰岛样ECC可降低糖尿病小鼠的血糖水平，可能是治疗糖尿病的替代细胞来源。2016年，Vegas等[32]诱导hESC产生了成熟的β细胞，将其移植到STZ诱导的糖尿病小鼠腹腔内，发现其可调节糖尿病小鼠的血糖，且可维持小鼠正常血糖水平超过70 d。

2.3 来源于iPSC的胰岛类器官

由于目前ESC在临床上的应用受到伦理道德限制，而具有特定基因型的iPSC在药物研究等方面比ESC更具吸引力，使得iPSC成为能无限分泌胰岛素的重要细胞来源[33]。最新研究表明，iPSC不仅能生成特异性的细胞类型，在疾病治疗、药物筛选和再生医学等方面也具有重要意义[34]。iPSC治疗T1DM属于再生医学范畴，其基本原理是将体细胞逆转为早期未分化的多能干细胞，再经各种细胞因子处理以模仿胚胎细胞的生长发育过程，诱导其变成具有分泌胰岛素功能的胰岛β细胞[35]。2010年，Alipio等[36]利用4种病毒转录因子将正常小鼠皮肤成纤维细胞重编程为iPSC，再将iPSC在体外诱导分化为胰岛β样细胞，通过门静脉注射的方式将其移植到糖尿病小鼠体内，术后2 d开始监测小鼠空腹血糖，发现移植小鼠血糖水平正常，而对照组小鼠仍然处于高血糖状态。2012年，Jeon等[37]从NOD/SCID小鼠成纤维细胞中衍生出iPSC，并使用定向分化的方法将其诱导为功能性胰岛细胞，随后使用STZ诱导NOD/SCID小鼠建立糖尿病模型，将功能性胰岛细胞移植到小鼠的肾包膜下，发现移植术后2～4 d小鼠血糖水平逐渐恢复正常，而对照组小鼠血糖＞18.3 mmol/L。2013年，Wang等[38]将小鼠胚胎成纤维细胞通过慢病毒转染的方式重编程为iPSC，再将iPSC诱导分化为胰岛样细胞，随后将胰岛样细胞移植到STZ诱导的糖尿病小鼠的肝左叶，6～7 d后小鼠的胰岛素分泌和血糖水平逐渐正常化，表明iPSC衍生的胰岛样细胞具有逆转高血糖的能力。2015年，Raikwar等[39]首先利用激活素A使人iPSC衍生出内胚层，在视黄醇和角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）的作用下产生表达Pdx1的胰腺内胚层细胞，随后产生内分泌祖细胞，最后内分泌祖细胞自发地产生胰岛样细胞簇。为明确胰岛样细胞能否纠正糖尿病小鼠的高血糖，研究者将胰岛样细胞移植到STZ诱导的Rag2糖尿病小鼠肾囊下，术后150 d内定期监测小鼠空腹血糖，结果发现小鼠血糖水平显著下降。2016年，Yabe等[40]将人iPSC诱导分化为胰岛β细胞，随后用STZ诱导SCID小鼠建立糖尿病模型，将胰岛β细胞移植到SCID糖尿病小鼠的左肾囊，对照组注射磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），每周 1 次尾静脉取血监测小鼠血糖水平，发现移植了胰岛β细胞的20只糖尿病小鼠中，6只在术后4周内血糖水平逐渐降低，而对照组小鼠仍维持较高血糖水平。

2.4 来源于共培养的胰岛类器官

2011年，Saito等[41]将iPSC和小鼠胚胎胰岛细胞在体外共同培养，形成了能够产生胰岛素的细胞群，该细胞群由胰岛α细胞包绕中央的β细胞组成，与成年鼠的胰岛相似。随后，研究者通过肾囊注射的方式将iPSC与胚胎小鼠胰岛细胞共培养产生的β细胞移植到糖尿病小鼠体内，发现小鼠随机血糖水平显著下降，表明iPSC和胚胎小鼠胰岛细胞共培养产生的β细胞具有降血糖的作用。2019年，Lebreton等[42]将 人 羊 膜 上 皮 细 胞（human amniotic epithelial cell，hAEC）与胰岛细胞在体外共同培养成功能性的胰岛类器官，随后将150个胰岛类器官移植到SCID糖尿病小鼠肾囊下，发现小鼠的随机血糖水平在1个月内显著改善。

2.5 来源于基因重组的胰岛类器官

有研究表明，神经源素3（neurogenin 3，Ngn3）是胰腺中胰岛干细胞的重要标志，也是胰岛β细胞再生的重要标志，具有促进胰岛干细胞向胰岛β细胞分化的作用[43]。Pdx1是胰腺发育和功能维持的关键因子，在胰岛β细胞的发育成熟及胰岛素的调控中发挥着关键作用，其缺失可能会导致糖尿病的发生[44]。Vilarino等[45]发现敲除绵羊的Pdx1基因后，新生的绵羊体内仅发现部分胰腺残余结构，组织学检测未发现胰岛。肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A，MafA）参与胰岛素的分泌过程，是β细胞特异性转录因子，其表达与外周血糖水平相关[46]。

2014年，Chen等[47]通过将Ngn3、Pdx1和MafA等关键转录因子转导入肠道隐窝细胞，成功地将其重编程为胰岛类器官，这种胰岛类器官有着与β细胞相似的超微结构并能分泌胰岛素。为了确定肠道来源的胰岛样细胞能否替代胰岛β细胞发挥功能以维持血糖稳态，研究者采用STZ诱导糖尿病小鼠，注射后4 d所有小鼠的随机血糖水平均显著升高，随后给予多西环素治疗3 d以产生Ngn3、Pdx1和MafA，发现Ngn3、Pdx1和MafA的表达可促进肠道隐窝细胞向胰岛样细胞的快速转化。再将胰岛样细胞移植到糖尿病小鼠体内，发现糖尿病小鼠血糖水平逐渐恢复正常，表明肠道来源的胰岛样细胞能有效调节糖尿病小鼠的血糖。胃肠道上皮是一种高度再生的组织，在进行细胞重编程后，有潜力成为胰岛素阳性细胞的可再生来源。2016年，Ariyachet等[48]研究表明，可通过添加多西环素使Ngn3+内分泌祖细胞表达Ngn3、Pdx1和MafA，继而使胃肠道中的内分泌细胞大量重编程为胰岛素阳性细胞，将该胰岛素阳性细胞移植到STZ诱导的糖尿病小鼠体内，发现移植小鼠的血糖水平保持正常，而对照组小鼠因高血糖在8周内死亡。

3 小 结

综上所述，胰岛类器官可以来源于胰岛细胞、ESC和iPSC，也可以通过两种不同细胞共培养或者基因重组等方法获得。目前主要的基础应用是将胰岛类器官移植到动物体内，使其分泌胰岛素，从而调节血糖，治疗糖尿病。hPSC具有无限增殖和多向分化等潜能，在疾病治疗、疾病建模和药物开发等方面具有巨大的潜力。与ESC不同的是，iPSC只能形成新的组织和器官，不能形成新的个体，所以能够避免潜在的医学伦理问题，而且细胞来源于病人自身，可减少或完全避免排斥反应。由此可知，iPSC是胰岛β细胞的主要来源，但由于iPSC疗法体外诱导过程复杂，目前利用iPSC治疗T1DM仍停留在基础研究阶段，如何优化iPSC定向分化为胰腺内分泌细胞的条件，提高诱导分化的效率，促进体外分泌胰岛素细胞的成熟，将胰岛类器官移植到糖尿病病人体内，实现基础应用向临床应用的转化，是未来研究的重点。