细胞外囊泡在肝移植中的应用进展

贾德功 贾志兴 郭珊珊 程颖

肝移植是目前治疗终末期肝病和肝脏不可切除性肿瘤的最终方法，但存在供者短缺、费用高、手术对机体的创伤较大、受者需要长期服用免疫抑制剂预防排斥反应以及可能发生其他严重并发症等局限性[1-2]。其中缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）和排斥反应是导致肝移植失败的重要原因。目前，对于IRI的治疗大多停留在支持阶段，缺乏特异性的药物和治疗方法，并不能很好地缓解IRI[3]。自20世纪80年代以来，钙调磷酸酶抑制剂和其他免疫抑制剂的临床应用使移植物1年存活率升高至80%[4]。但免疫抑制剂的长期使用会出现严重的不良反应，如恶性肿瘤、机会性感染、代谢紊乱和器官毒性等，肝移植术后存活超过1年的受者中，恶性肿瘤和感染是两大主要死因，分别占16.4%和10.5%[5]。因此，急需研究出一种既能减轻IRI和排斥反应，又不影响受者整体免疫功能的新方法，以减少肝移植术后并发症，提高肝移植的成功率。

细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是由真核细胞和原核细胞释放到细胞外微环境、被磷脂双层膜包裹的纳米颗粒[6-7]，包括外泌体（exosome）、微 囊 泡（microvesicle） 和 凋 亡 小 体（apoptosis body）[8]。但由于某些特征和内容物的重叠，很难区分其不同的亚型。EV可携带多种参与细胞内信号转导的物质，如微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA，miR）、小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）、DNA、蛋白质和脂质等[9]。在众多体外和体内研究中，来自多种细胞系的EV已被证明具有免疫调节、抗氧化、抗炎和组织修复等特性。有研究表明，在大鼠肾移植低温灌注期，EV具有减轻移植物IRI和抑制排斥反应的作用[10]。而肝脏是EV治疗的理想靶器官，因为EV经绝大多数系统给药后，均会积聚在肝组织中[11]。动物实验已经证明，IRI前、中、后使用EV，均可减轻组织损伤并促进组织修复[12]。这使EV成为肝移植领域一种十分具有吸引力的治疗选择。然而EV的实际临床应用仍面临着巨大的挑战，包括EV的分离、纯化、鉴定、储存和靶向递送等。本文将总结EV在肝移植方面减轻IRI和促进同种异体移植物免疫耐受的作用机制，讨论EV应用于临床所需解决的问题，并对该领域未来的研究方向进行展望。

1 EV在肝IRI中的作用机制

1.1 修复自噬

近期研究表明，肝脏发生IRI后，增强自噬可提高肝细胞的活性和功能[13]。自噬长期以来被认为是对细胞应激的适应性反应，而细胞应激是一种防止细胞死亡的手段。在肝脏正常生理条件下，基础水平的自噬可降解线粒体、衰老的细胞质和受损的蛋白，从而调节肝细胞脂质代谢、免疫应答和细胞死亡。当细胞受到缺血和缺氧等应激时，自噬被激活。但目前关于自噬在肝IRI中的变化和作用机制仍然不是很清楚。

研究表明，IRI可导致线粒体自噬紊乱，清除受损的线粒体能够预防活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生从而免受氧化应激损伤[13]。EV可以恢复线粒体自噬，而线粒体自噬可以通过减少细胞内钙离子浓度和抑制分解代谢来缓解IRI[14]。Yang等[15]在小鼠部分肝IRI模型中，分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞并将其转化为间充质干细胞-肝细胞过渡表型细胞，从中分离出EV，再灌注前后通过尾静脉注射到小鼠体内。结果发现，与对照组比较，EV处理组小鼠肝损伤程度较轻，且微管相关蛋白质轻链 3（microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3）-Ⅱ、p62和Beclin-1等自噬相关蛋白的表达水平发生了变化，表明IRI导致的线粒体异常自噬被修复。另一项研究在大鼠肝IRI模型中注射人脐带血来源的间充质干细胞分泌的EV，发现EV与miR-20a共同应用除了肝保护作用，还可以修复自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的异常表达[16]。以上研究表明，自噬过程的修复在EV对移植物条件改善中起到重要作用。

1.2 免疫抑制

在大鼠IRI模型中，注射人脐带来源的间充质干细胞分泌的EV降低了促炎因子干扰素（interferon，IFN）-γ、 肿 瘤 坏 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白细胞介素（interleukin，IL）-6的表达水平，并减少了中性粒细胞浸润和呼吸爆发[17]。有研究发现，间充质干细胞分泌的EV可降低促炎因子IL-6和CC趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）7 的表达水平，增强NOD样受体蛋白（NOD-like receptor protein，NLRP）12的表达，而NLRP12是一种可通过抑制非典型核因子（nuclear factor，NF）-κB信号通路抑制炎症反应的蛋白[18]。Sun等[19]也发现在大鼠IRI模型中，注射小型猪脂肪细胞来源的间充质干细胞分泌的EV，可使巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和自然杀伤细胞的CD11、CD14和CD161表型的表达减少，且联合应用褪黑素可以增强EV的免疫抑制功能以及对肝脏的保护作用。Nong等[20]发现在大鼠IRI模型中，注射间充质干细胞分泌的EV可减轻中性粒细胞和巨噬细胞浸润，降低髓过氧化物酶、TNF-α和IL-6等促炎因子的表达。也有研究者在小鼠IRI模型中发现，注射骨髓来源的树突状细胞分泌的EV可以减轻肝IRI，并通过诱导T细胞分化为调节性T细胞来调控免疫反应[21]。遗憾的是，这些研究均未提及EV对肝脏的长期影响。

有研究者在大鼠肝移植模型中发现，树突状细胞分泌的EV可以减轻肝损伤并且延长移植物存活时间，减少免疫细胞浸润，促进调节性T细胞增殖和缓解同种异体移植排斥反应[22]。有趣的是，使用EV和调节性T细胞联合治疗的9只大鼠中，6只生存时间超过100 d，而未接受治疗大鼠的中位生存期仅为10 d[22]。

以上研究阐示了EV对肝移植的免疫抑制机制，未来可通过研究肝免疫细胞群的表型和细胞因子信号通路，进一步探讨影响移植物存活的免疫学机制。

1.3 组织再生

EV也能促进IRI后肝组织再生。在小鼠部分肝切除模型中，来自成人肝干细胞的EV能够减少细胞凋亡并促进肝细胞增殖，且成人肝干细胞分泌的EV可促进70%肝切除大鼠的肝组织再生[23]。同时，多项研究发现，在IRI前注射间充质干细胞分泌的EV可以增强肝细胞Ki-67（一种细胞增殖标志物）的表达，这表明间充质干细胞分泌的EV可以刺激肝细胞增殖，从而促进IRI后肝组织再生[20,24]。Du等[10]通过观察增殖细胞核抗原（proliferating nuclear antigen，PCNA）和磷酸化组蛋白 H3（phosphorylated histone H3，PHH3）等细胞增殖标志物发现，注射EV可以促进IRI后肝细胞的增殖。同时，该研究通过体外和体内实验，探索了诱导增殖的信号通路，发现鞘氨醇-1-磷酸酯（sphingosine-1-phosphate，S1P）/鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）通路在肝细胞增殖中起重要作用。Nojima等[25]也发现EV可以携带SphK2刺激靶肝细胞S1P的产生，从而促进肝细胞增殖和肝组织再生。有趣的是，该研究通过静脉向小鼠分别注射肝细胞、枯否细胞或血窦内皮细胞分泌的EV，发现只有肝细胞分泌的EV能起到作用。同时，Anger等[24]发现间充质干细胞分泌的EV可促进氧化应激后肝细胞增殖，而成纤维细胞分泌的EV未能对损伤的移植物产生类似的保护和再生作用。表明EV的保护和再生作用取决于来源的母细胞性质。

2 EV临床应用面临的挑战

2.1 制 备

EV的临床应用仍面临着巨大的挑战。首先需要解决的是EV的制备问题。临床应用级EV的培养需从细胞库中选出具有遗传稳定性的特定细胞系进行体外扩增和培养。当EV达到一定浓度时，则需进一步分离和纯化EV。目前已有多种技术用于分离和纯化EV，其中超速离心法是使用最为广泛的方法[26]。超速离心法可以根据密度从其他样品组分中分离和浓缩EV，但存在产量低、仪器昂贵、处理时间长以及损伤EV外膜等缺点[27]。超速离心法得到的EV可以通过追加密度梯度步骤进一步提纯[28]。凝胶排阻色谱法产量高、仪器便宜、简单和高度可扩展，且可以兼容动态药品生产质量管理规范（current Good Manufacturing Practices，cGMP），得到了越来越多的认可，但其受限于对EV的分辨率低[29]。其他方法包括过滤、沉淀和试剂盒等，均存在产量低、破坏EV的完整性、价格昂贵或不符合cGMP等缺点[30-31]。为了克服这些缺点，人们正在积极探索新方法，如在切向流过滤装置和生物反应器中培养细胞，通过尺寸排除层析法提高EV产量和纯化EV[32]。同样，乙醇调节和三维灌注生物反应器的联合使用也被证明可以提高EV的产量和效能[33]。无论选择哪一种分离和纯化方法，都应着重评估该方法对EV制备和功能的影响。

2.2 储 存

EV的长期储存也是临床应用的一个关键问题。虽然有研究表明EV经过反复冻融，在-20 ℃保存6个月后仍可保持稳定性，但也有研究表明在3次冻融循环后，EV的完整性就会丧失[34-35]。EV可以进行冻干制成现成产品，在保留其功能的同时降低生产和存储成本[36]。然而，存储介质在EV完整性中起着至关重要的作用，即使少量的离子也会引起pH值变化，导致EV聚集和功能丧失[37]。因此，需要优化长期存储条件，防止EV功能损害。

2.3 递 送

EV的另一项临床应用的挑战是特异性递送到靶细胞。研究者们在动物实验中对不同EV给药途径进行了评估，其中静脉给药是最为常见[38]。一些关于EV治疗作用的研究描述了通过静脉给药的方式将间充质干细胞或脂肪干细胞分泌的EV递送到靶器官或组织，如肺血管、颈动脉、心脏、肺、胰腺、肝脏和结肠[39-45]。基于这一证据，静脉注射间充质干细胞或脂肪干细胞分泌的EV似乎不能为特定器官提供足够的特异性。同时，值得一提的是，这些研究大多没有评估相同的实验方法是否会对除靶器官或靶组织之外的其他器官或组织产生影响。因此，对EV表面蛋白质组和靶细胞表面聚糖图谱的特性描述可以显著提高EV靶特异性。

3 EV的潜在应用

目前已有多家公司参与了EV疗法的早期开发，其中几家已经进入Ⅲ期临床试验[46]。如美国Aegle Therapeutics公司使用骨髓来源间充质干细胞分泌的EV治疗大疱性营养不良；美国Aruna Biomedical公司使用神经干细胞分泌的EV治疗脑卒中和肌萎缩侧索硬化；澳大利亚Exopharm公司使用来源于自体血小板分泌的EV促进伤口愈合。以上证据表明EV在临床应用中具有较大的潜力。研究开发具有成本效益、符合cGMP要求的方法和设施，用于大规模生产临床级EV，是实现EV广泛临床应用的必要条件。尽管具有挑战性，但将为EV未来的治疗应用打开大门。

在过去的十年里，人们逐渐认识到EV在细胞间信号传递中的作用及其作为生物标志物的潜能。体外和体内研究表明EV具有免疫调节、抗氧化、抗炎和组织修复等特性，且EV受到囊泡膜蛋白的保护，因此具有一定的稳定性和生物安全性。迄今为止，已有多项研究探索了EV作为一种新的治疗方法在减轻肝IRI和同种异体肝移植模型移植物损伤中的作用，证实了EV具有改善肝IRI的潜力，并阐述了潜在的机制，包括修复自噬、免疫抑制和组织再生。以间充质干细胞为代表的细胞疗法适合应用于肺IRI，因为静脉注射的细胞体积大，往往被困在小的肺毛细血管中，促进其在肺组织中积聚[47]。与之相反，肝脏由于血管开窗作用和枯否细胞驻留，可以促进纳米颗粒在其中选择性沉积[48]。EV在肝脏中高水平积聚，因此肝脏是EV作用的理想靶点。另外，在肝移植领域，EV的给药时间更是十分灵活，可在缺血前（器官动脉夹闭）、在器官保存或体外灌注期间、再灌注前以及再灌注后。体外机械灌注更是为EV在肝移植领域的应用提供了一种新的选择。在移植前将EV递送到供肝，避免了在获得供肝前进行器官修整的相关伦理问题。

为了进一步改善治疗方法，可以在EV内装载具有减轻炎症反应、抑制细胞死亡或者降低氧化应激水平的药物。通过合成纳米颗粒进行给药在临床中已十分常见[49]，这种方式有助于从对同一疾病统一治疗的旧模式向根据病人参数进行个体化治疗的新模式转变。例如，脂质体是一种在大小、形状和结构上与EV相似的人工合成纳米颗粒级别的脂质，自20世纪90年代以来，一直被用于递送化学药物治疗（化疗）药物和抗真菌药物到病人体内，改善了药物的药代动力学和特异性靶向递送，减少了药物的不良反应，提高了治疗效果[50-53]，但仍存在着高免疫原性、高毒性和高清除率等缺点[54]。而EV则表现出较低的毒性和免疫原性，且较少被巨噬细胞吞噬，因此可以在循环系统和组织中停留较长时间[55]。截止至投稿日，美国国立卫生研究院网站已经注册了51项涉及使用治疗性EV的临床试验，包括通过植入EV将姜黄素递送到结肠癌组织中（NCT01294072）、通过EV将治疗性siRNA递送到胰腺癌组织中（NCT03608631）等。虽然目前还没有研究结果，但这些研究可能会为EV递送治疗药物的临床实践提供借鉴。不仅如此，类似其他人工合成的纳米颗粒，EV未来的潜在应用还应包括联合疗法，即不同的药物被共同装载到EV中，以确保受体细胞暴露于最佳的药物浓度比例中[56-58]。

4 小结与展望

部分动物模型研究表明EV具有缓解IRI和促进同种异体移植物免疫耐受的作用，但其安全性还需要进一步研究。EV的临床应用面临着生产、分离、纯化、储存以及将如何将EV递送到靶细胞等问题。尽管关于EV的众多问题仍未得到解答，技术和实验方面的挑战也阻碍了其从实验室到临床试验的转化，但这种新颖的方法具有极高的应用前景。总之，在肝移植中，EV是一种十分具有吸引力的新型治疗方法，具有改善肝IRI和减轻排斥反应的潜力，值得进一步研究。