circRNA在骨骼肌中的研究进展

向娅，柴志欣，武志娟，钟金城，信金伟

(1.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省、教育部重点实验室，成都610041;2.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，拉萨850000)

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类不具有5'端帽子和3'端poly(A)尾巴的共价闭合的环形RNA分子，由pre-mRNA经过反向剪接(backsplicing)形成。circRNA最早于1976年被偶然发现，该类病毒RNA无法在其5'或3'末端进行酶标记，也无法被蛇毒磷酸二酯酶降解。1979年，Hsu等［1］利用电子显微镜鉴定出一些在真核细胞质中具有环状结构的RNA分子，但由于它们丰度低且不常见的特征，在随后的几十年这类RNA均被认为是剪接错误的产物，并未引起广泛关注。随着高通量测序技术和生物信息学技术的快速发展，2012年首次报道通过RNA-Seq方法鉴定了约80个circRNAs，circRNA才正式进入科学家的视野。随后科学家们先后在人［2］、猪［3］、牛［4］等物种上发现了circRNA。近年来，大量的研究表明circRNA在生物的生长发育、疾病发生和发展等方面发挥重要作用。本文就circRNA的形成机制、生物学功能及其在动物骨骼肌形成中的功能研究进行概述，以期为今后探索circRNA在动物骨骼肌中的功能及分子机制提供参考。

1 circRNA的形成机制

circRNA是经过转录后由上游3'剪接位点和下游5'剪接位点反向剪接形成，没有自由5'末端帽子和3'末端poly(A)尾的共价闭合环形分子［5，6］。因核酸外切酶无法识别这种特殊的结构而不易降解，从而确保了circRNA的稳定性。circRNA可来源于基因组的任何区域，长度从几百到几千个核苷酸不等。根据circRNA分子的基因来源，主要分为3类，外显子circRNA(circular exonic RNA，ecirRNA)、内含子circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)、外显子-内含子circRNA(exon-intron circRNA，EIciRNA)。研究者认为不同circRNA的形成受不同的剪接机制调控，而以上3种类型的circRNA在其功能上是否会有所不同，有待进一步研究。

外显子环状RNA最丰富，主要存在于细胞质中。其形成机制有两种，直接反向剪接和外显子跳跃，这两种形成机制与经典剪接体相关，但直接反向剪接可能比外显子跳跃发生的更频繁。EIciRNA是circRNA的特殊亚型，在哺乳动物细胞中被发现，当两个以上的外显子在环化时，它们之间的内含子可能滞留其中，形成既有外显子又有内含子的EIciRNA［7］。有研究表明，EIciRNA的形成机制可能与ecircRNA相似，但内含子保留的机制尚不清楚。内含子环状RNA主要存在于细胞核中，在释放5'外显子后，末端3'-OH攻击3'剪接位点，生成ciRNA并释放3'外显子［8］。研究发现，部分内含子在剪接作用中会形成套索结构，但很快被脱分支降解［9］。作为一类特殊的内含子circRNA，tricRNA(tRNAintroniccircRNA)是由pre-tRNA剪切后形成的［10］，tricRNA形成必须含有保守的tRNA序列基序和加工酶。

2 circRNA的生物学功能

circRNA主要存在于细胞质或外泌体中，具有组织、疾病、时序、发育阶段特异性及高稳定性等特征［11］，circRNA特殊的结构特征使其具有特定的生物学功能。研究发现，circRNA参与了基因转录及转录后调控，通过不同的作用方式在细胞生命活动中发挥重要功能［7］。

2.1 miRNA sponge

circRNA富含miRNA结合位点，通过碱基互补配对吸附miRNA，阻止miRNA在3'非翻译区与mRNA相互作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达，发挥竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的功能［12］。由于circRNA的长度和序列不同，其结合的miRNA分子数量与种类也各不相同。

目前已发现7种circRNA具有miRNA“海绵”作用。CDR1as是在哺乳动物(主要是人和小鼠)脑中高度保守、高丰度的ecircRNA［5，6］，含有70多个miR-7的结合位点，通过吸附miR-7a调控其靶基因PARPA和SP1的mRNA表达水平［13］，因此，CDR1as被称为miR-7的circRNA“海绵”。Sry转录而来的circRNA包含16个miR-138的结合位点，可通过吸附miR-138抑制其活性，从而调控多种生理病理过程［14］。circITCH可与miR-7、miR-17和miR-214结合，导致ITCH表达上调，进而抑制WNT信号通路［15］。通过功能恢复实验发现circHIPK3能直接与miR-124结合，沉默circHIPK3抑制细胞生长［16］。

2.2 调控蛋白结合

circRNA可与mRNA调节的结合蛋白(RNAbinding protein，RBP)结合形成RNA-蛋白质复合体(RNA-protein complex，RPC)，进而改变剪接模式或mRNA稳定性。Du等［17］研究显示，circFOXO3可与抗衰老蛋白ID1、转录因子E2F1及低氧诱导因子1亚单位α(hypoxia inducible factor 1 subunit α，HIF1-α)相作用，阻止RBP蛋白的核定位，导致心脏衰老。盲肌(muscleblind，MBL)与其亲本基因第2外显子相结合，可促进其环化生成circMbl，Ashwal-Fluss等［18］研究发现，MBL与circMbl相互作用，可调控circMbl和动脉粥样硬化性心血管疾病相关因子circANRIL与必需的PES1相结合，抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞中核糖体的生物合成，进而导致核仁应激和细胞死亡［19］。

2.3 调控基因转录

研究表明，circRNA能够调控其亲本基因的表达。ciRNA可与RNA聚合酶Ⅱ相互作用调节基因的转录，目前已知的ciRNA有ci-ankdr52、cimcm5和ci-sirt7等。EIcircRNA与小核糖核U1 snRNP相互作用形成复合体，该复合体可在其亲本基因启动子区与RNA聚合酶Ⅱ结合，调控其亲本基因的表达［7］。研究发现，利用RNAi技术敲低circEIF3J和circPAIP2的表达，可降低EIF3J和PAIP2的转录［7］。而其它circRNAs能否以类似的方式参与基因的调控还有待进一步探索。Conn等［20］研究发现，circSEP3可与SEP3基因座结合形成R-loop(RNA与RNA杂交环)，减弱线性SEP3与DNA的结合，从而导致circSEP3过度表达产生的拟南芥花与正常植物表型存在差异。

2.4 编码翻译功能

circRNAs因缺少5'端帽子和3'端poly(A)尾巴不能进行帽依赖性的蛋白质翻译，故早期被认为无法翻译编码蛋白。随后科学家们逐渐发现circRNA可通过特殊的方式进行蛋白质翻译，部分circRNA可通过作为内部核糖体进入位点(IRESs)的序列，促进起始因子或核糖体直接与可翻译circRNAs的结合;circRNA在缺乏IRES、poly(A)和5'帽结构的条件下，可通过RCA机制翻译蛋白质;在IRES人工引入circRNA分子后，其可在293T细胞中进行蛋白质翻译;circRNA含有多个m6A甲基化修饰位点，在单个m6A的驱动下circRNA可翻译合成蛋白质。

3 circRNA在骨骼肌中的相关研究

目前，有关circRNA的研究主要集中在医学方面，如癌症发生、心血管疾病等生理病理过程，而在肌肉生长发育方面的研究鲜有报道，尤其是与动物骨骼肌生长发育相关的circRNA。研究表明，动物肌肉生长发育除了受骨骼肌转录调节因子Myf4、Myf5、Myf6、肌细胞生成素(Myogenin)，肌细胞增强因子家族(Myocyte enhancer，MEF)等主效基因的调控，也受circRNA、lncRNA等非编码RNA的调控［21-23］。肌细胞增殖分化是影响肌肉发育重要的因素，因此研究者推测circRNA在肌肉生长发育过程中具有重要功能。

3.1 猪

许多学者就circRNA在骨骼肌中的调控作用在家养动物中开展了相关研究。Liang等［23］对贵州小型猪的9个器官和3个不同发育阶段的骨骼肌进行circRNA全基因组分析，发现149个circRNAs与肌肉发育相关，并构建了首个猪的circRNAs数据库。而且circRNA对骨骼肌的调控机制具有时序性，在猪出生0～30d时，circRNA主要对骨骼肌的生长发育和肌纤维类型转换进行调控，而在30～240d时，其主要调控骨骼肌糖代谢和钙离子信号。Sun等［24］对长白猪和蓝塘猪的背最长肌进行转录组测序，筛选出236个差异表达的circRNAs，其中40个circRNA参与到26种miRNA介导的ceRNA相互作用的海绵调节剂，并提出circRNA可能对猪骨骼肌发育有潜在的转录后调控作用。Liu等［25］对大白猪肌肉转录组分析发现，肌肉中差异表达基因主要富集在TGF-β、MAPK等信号通路中，而TGF-β可通过促进纤维细胞增殖调控肌肉发育，使大白猪出生后肌肉肥大。Voillet等［26］对不同胚胎期的大白猪骨骼肌发育机制进行多组学关联分析，结果表明，转录物和蛋白质的功能主要集中在骨骼肌发生后期至肌肉成熟阶段的物质能量代谢过程中。目前，对猪骨骼肌中circRNA的研究主要以筛选和鉴定为主，在肌肉发育中的功能及调控机制方面的研究尚少，可能是因为功能调控方面的研究涉及到细胞层面，需要对猪胚胎、幼年和成年时期进行屠宰。因此，circRNA与猪骨骼肌生长发育的关联还有待进一步研究。

3.2 牛

魏雪峰等［27］研究了秦川牛骨骼肌两个发育阶段(胚胎和成年肌肉长肌)的circRNA表达谱，鉴定出1个在牛肌肉中特异性表达的circLMO7，发现circLMO7可竞争性结合miR-378a-3p，解除对靶基因HDAC4的抑制作用，从而调控肌细胞的增殖分化。Li等［28，29］研究发现，circFUT10、circFGFR4分别通过吸附miR-133a和miR-107调控秦川牛骨骼肌细胞的增殖分化过程。上述研究表明，circRNA在秦川牛骨骼肌发育过程中具有重要调控作用。然而，尚未有circRNA在牦牛骨骼肌发育过程中的相关研究，主要是涉及到牦牛批量屠宰，且牦牛多为高原地区牧民散养，批量购买经费较多。今后可在秦川牛的研究基础上，开展circRNA与牦牛肌肉生长发育的关联性研究，通过研究其肌肉发育相关circRNA提高牦牛产肉率及肉品质特性，为牦牛分子育种提供理论依据，同时可从非编码RNA的角度探索牦牛与其他牛种的遗传特性。

3.3 绵羊

石田培等［30］研究显示，绵羊大多数差异表达circRNA主要富集MAPK信号通路中，MAPK信号通路是参与调控肌细胞增殖分化的关键通路，直接或间接地参与绵羊胚胎肌肉的发育调控。在比较组中还发现circRNA2324只在D85和D105两个阶段上调，在D135时显著下调，说明在胚胎骨骼肌发育后期，circRNA2324的作用受到抑制。Li等［31］使用RNA-Seq分析了胚胎、成年时期哈萨克绵羊肌肉中circRNAs的表达情况，发现多个circRNAs含有与肌肉生长发育相关miRNAs的多个吸附位点，如oar_circ_0001413同时包含miR-133、miR-125、miR-107等多个miRNAs结合位点。circHIPK3可通过结合到9个miRNAs的18号结合位点调控细胞生长，因此推测绵羊肌肉的生长发育可能受到circRNA的内源性调控。

3.4 人、猴和鸡等其他物种

Kotb等［32］研究发现，circRNA在猴子的骨骼肌发育中存在大量年龄依赖性的表达，直接或间接的调控肌原性转录因子和肌原性视黄醇结合蛋白。Ouyang等［33］对鸡3个发育时期腿肌的circRNAs进行转录组测序，在946个外显子circRNAs中发现有150个已知的miRNA的结合位点，circRBFOX2可竞争性结合miR-206抑制成肌细胞的增殖分化。

circRNA调控人体骨骼肌生长发育及相关疾病的发生方面也开展了大量研究。Legeini等［34］研究发现，circ-ZNF609直接翻译出来的蛋白可以调控肌肉的生长发育。Qian等［35］研究发现，circ19142、circ5846通过调节骨形态发生蛋白2(BMP2)促进成骨细胞的分化，且这两种circRNA正向调控成骨细胞的发育过程。李瑞［36］在C2C12成肌细胞中发现，肺腺癌转移相关转录因子Malat1可通过结合miR-133位点调控其靶基因SRF的表达，从而影响成肌细胞的分化。Liu等［37］的研究表明，circRNA-CER可作为ceRNA调节MMP13的表达从而调控软骨细胞胞外基质的降解过程，推测circRNACER可作为骨关节炎潜在的治疗靶点。上述研究表明，circRNA在人骨骼肌的生长发育过程中也发挥重要作用，推测circRNA可能成为一种疾病诊断、预测方面的生物标志，尤其在癌症的发现和预防方面具有重要作用。以上研究显示，对猪、猴骨骼肌中circRNA的研究以筛选和鉴定为主，牛、绵羊、鸡和人中circRNA的研究主要涉及到其miRNA“海绵”作用，对circRNA调控各物种骨骼肌生长发育的机制研究还不够深入，很多动物肌肉生长发育的相关因子有待进一步鉴定，其功能还待进一步阐明，因此需加强对动物骨骼肌生长发育相关circRNA的鉴定、功能及调控机制等方面的研究，为进一步从功能调控方面探索与动物肌肉发育相关的circRNA，检测其对下游靶基因表达的影响和改善动物遗传素材提供基础数据。

4 小结

circRNA特殊的闭合环状结构预示着它具有潜在的新功能，在未来可能成为一种新型的生物学标志。随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展，越来越多的circRNA被发现，但目前circRNA的研究仍处于起步阶段，主要以筛选和鉴定为主，有很多问题亟待解决，如circRNA数据库尚未建立完全，仅建立了人、猪、小鼠的circRNA数据库;circRNA的生物学功能也尚存一定争议;在高通量测序时需要减少检测带来的假阳性;circRNA的研究已涉及多个领域，如基因转录、信号转导、细胞增殖分化等，但其分子形成机制、生物学功能及在肌肉生长发育中的调控机制仍需进一步研究探索，尤其是与动物骨骼肌生长发育相关的circRNA。可能是因为circRNA是一种新型环状分子，研究较少，缺少相关研究的参考文献;部分物种生长周期长，不便于采集样品;进行circRNA的鉴定和功能分析，需要屠宰一定量的动物以采集试验样品，采买经费较高。目前已有研究表明，circRNA在动物骨骼肌生长发育过程中具有重要调控作用，这或将成为动物遗传育种工作的新思路。因此，进一步挖掘新的circRNA，鉴定其种类及表达模式，探索circRNA调控网络，阐明其对动物肌肉生长发育的作用机制，为深入研究动物肌肉生长发育提供新的基础数据。随着信息技术和研究工具的不断发展，相信在不久的将来，circRNA在调控动物肌肉生长发育方面的研究将有突破性进展。