基于网络药理学及分子对接探讨芪明颗粒治疗糖尿病视网膜病变的作用机制

董照阳，胡欣欣，陈茜，魏伟

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）属于糖尿病常见的微血管病变，也是主要的致盲原因。玻璃体腔内注射抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）药物已在临床上广泛使用。虽然抗VEGF药物在DR的治疗中取得了不错的效果，但是也存在术后不良反应的现象[1]。芪明颗粒由成都中医药大学研制而成，利用现代工艺制药，在DR治疗中广泛应用。该方由8味中药组成，主要作用包括滋养肝肾、益气生津、通络明目。根据目前临床观察和实验研究，都未能精准明确地指出芪明颗粒治疗DR 的有效活性成分、作用靶点和作用机制。网络药理学是在系统生物学和药理学相关方法的基础上发展起来的，从“多成分-多靶点-多途径”系统地研究中药与机体之间的作用机制，在研究中药药效作用中被广泛应用[2]。本次研究拟用网络药理学方法，对芪明颗粒治疗DR 作用机制进行探讨和研究，为临床应用提供科学的参考。

1 对象与方法

1.1 芪明颗粒相关活性成分和药物靶点的筛选

通过TCMSP 数据库分别收集黄芪、葛根、熟地黄、枸杞子、决明子、蒲黄、茺蔚子、水蛭8 味中药的化学成分，以口服吸收利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和成药性（drug like index，DL）≥0.18 为条件筛选作为筛选参数，记录成分的编号和名称。再通过TCMSP 数据库搜索候选化合物相关的潜在靶点，并应用UniProt 数据库检索上述靶点名称，确认人源靶点，获得靶点对应的基因名。

1.2 DR潜在作用靶点的筛选

GeneCards 数据库是一个集成大量web 源的以基因为中心的数据库，它可通过Gifts算法来计算靶点与疾病之间的相关度，本研究以相关性分数（Relevance score≥10）作为筛选条件；OMIM 数据库是用于描述人类遗传病以及基因研究的知识库。本研究通过GeneCards 和OMIM 数据库检索，以“diabetic retinopathy”为关键词进行搜索，获得与DR 相关的靶点。

1.3 化合物-靶点网络和蛋白相互作用网络图的构建与分析

将药物的成分靶点与DR 靶点取交集，得到芪明颗粒治疗DR的潜在作用靶点，并上传至Venny平台绘制图形。将有效化合物与其对应靶点数据导入Cytoscape3.7.2软件，绘制化合物-靶点网络图，并通过Network Analyzer 插件进行拓扑分析[3]。网络中成分和靶点用节点表示，成分与靶点之间的相互作用用边表示。将上述作用靶点结果输入到STRING 数据库中，选择“multiple proteins”模式，蛋白种属设为“Homo sapiens”，设定置信度为0.9，保存结果为TSV格式文件。然后使用Cytoscape 构建蛋白相互作用（the protein-protein interaction，PPI）网络并进行拓扑分析，根据中心度值（betweenness centrality，BC）、亲中心度值（closeness centrality，CC）和等级值（degree centrality，DC）筛选核心作用靶点，获得蛋白相互网络图。

1.4 基因本体富集分析和京都基因与基因组百科全书的通路分析

为了进一步了解上述靶标蛋白基因的功能以及在信号通路中的作用，将筛选得到的芪明颗粒作用的靶点导入DAVID 数据库，设定阈值P＜0.05，分别进行基因本体（gene ontology，GO）生物学过程富集分析和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析，从而分析药物治疗DR 靶点的主要生物学过程和代谢通路，并绘制柱状图和表格进行可视化分析。

1.5 分子对接验证

利用PDB 数据库查询主要核心作用靶点的蛋白结构，导入SwissDock 在线对接分析对接服务器，获得对接评分，以评价芪明颗粒关键化学成分与关键靶点之间的对接效果。

2 结果

2.1 活性成分和靶点的筛选

通过TCMSP 筛选和查阅文献得到活性化合物数目分别为黄芪20个，葛根4个，枸杞子45个，决明子14个，蒲黄8个，茺蔚子0个，水蛭0个，去除重复后，芪明颗粒共有活性成分81 个。收集TCMSP 数据库（UniProt 统一命名）和Swiss Target Prediction 数据库内中药所有靶点，经过筛选并删除重复，整合得到作用靶点299个。

2.2 疾病靶点的筛选

经GeneCards 数据库检索“diabetic retinopathy”获得相关的疾病靶点3473 个，选取相关度＞10 的靶点共770个。OMIM数据库检索获得相关的疾病靶点216 个。去除2 个数据库重复值，最终得到914 个治疗DR 的靶点。将疾病靶点与药物成分靶点输入Venny 软件绘制韦恩图，两者取交集后获得疾病靶点-药物成分共同靶点91个（图1）。

图1 芪明颗粒成分靶点和DR靶点韦恩图

2.3 化合物-疾病靶点相互作用网络图及拓扑分析

通过Cytoscape3.7.2软件构建芪明颗粒治疗DR化合物一靶点相互作用网络图，绘制活性成分和靶点网络（图2）。从图中可看出同一活性成分可作用于不同靶点，不同活性成分也可作用于同一靶点，由此可见，芪明颗粒多成分和多靶点的特点。通过Network Analyzer 对化合物-靶点图进行拓扑学分析，选取中心度值、亲中心度值和等级值均大于中位数的核心靶点和关键有效化合物。研究共筛选出关键活性成分21 种，主要为槲皮素、山奈酚、水蛭素、异鼠李素、毛异黄酮、黄豆黄素、7-O-甲基异丙醇胺、3'-甲氧基大豆苷元，花生四烯酸，beta-谷甾醇等（表1）。

表1 芪明颗粒关键化合物

2.4 蛋白相互作用网络构建与分析

将韦恩图中成分和疾病共有潜在靶点导入STRING 中，获得蛋白相互作用，保存其TSV 格式文件。将获取蛋白互作信息导入Cytoscape软件进行网络拓扑学分析得到芪明颗粒对DR作用靶点蛋白互作网络。中心度值、亲中心度值和等级值均大于中位数的靶点分别为信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、白细胞介素6（interleukin 6，IL6）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（sarcoma gene，Src）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、趋化因子（C-X-C 基序）配体8（Interleukin-8，CXCL8）、表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、白细胞介素1B（interleukin 1B，IL-1B）、和表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）等。这说明这些靶点是蛋白互作网络中的核心靶点，在网络中具有重要作用（图3）。

图3 蛋白互作网络图

2.5 芪明颗粒干预DR的GO富集分析和KEGG富集分析

通过数据库DAVID进行的GO功能富集分析得到128 个（P＜0.05）条目。生物过程条目85 个，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、血管生成的正调控、细胞对脂多糖的反应、对缺氧的反应、内皮细胞凋亡过程的负调控、炎症反应和免疫反应等；分子功能条目23 个，主要涉及细胞因子活性、生长因子活性、MAP激酶活性、DNA结合等；细胞组成条目20个，主要涉及细胞外间隙、质膜和质膜的外侧、胞质溶胶、线粒体等。绘制3 个模块条形图（图4、5、6）。KEGG通路富集分析得到96条（P＜0.05）信号通路，主要涉及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）信号通路、T细胞受体（T-cell receptor，TCR）信号通路、VEGF信号通路、雌激素信号通路、MAPK信号通路、脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol3-kinase/proteinkinaseB，PI3K/Akt）和核因子kappa B（nuclear factor kappa-B，NF-kB）信号通路等。这表明芪明颗粒的有效成分可能通过作用于这些信号通路来达到治疗DR目的（表2）。

图4 芪明颗粒干预DR的生物学过程分析图

表2 芪明颗粒治疗DR关键靶点参与的通路富集信息

2.6 分子对接验证

在蛋白互作网络中，将degree 值最高的前5 位关键化学成分与5 个关键靶点分输入至SwissDock进行分子对接验证（表3），蛋白质与小分子结合越紧密，Full Fitness 值越低。成分总分结果显示，Full Fitness 值较低的依次为槲皮素、山柰酚、水蛭素、异鼠李素、毛异黄酮等。选择山柰酚与STAT3、JUN、Src、IL6、AKT1 进行对接，结果显示山柰酚与靶点蛋白有较好的结合活性，并且分子构象结合稳定（图7）。

图7 山奈酚与靶蛋白分子对接图

表3 分子对接结果

图5 芪明颗粒干预DR的细胞组成分析图

图6 芪明颗粒干预DR的分子功能分析图

3 讨论

中医认为DR 属于“血灌瞳神”“视瞻昏渺”“萤星满目”“暴盲”“消渴目病”等范畴[4]。赵艳青等[5]认为，本病的病机为肝肾亏虚，气阴两虚；目络阻滞，痰瘀互结。中医药用于对DR 的临床研究越来越受到眼科医生和监管部门的高度关注[6-7]。芪明颗粒方中黄芪益气生血、通调血脉，为君药；葛根生津止渴，通调血脉，枸杞子滋补肝肾、养精益血，共为臣药；决明子、茺蔚子、蒲黄、水蛭等活血化瘀、利水消肿、滋肝补肾，共为使药。诸药合用共奏滋养肝肾、益气生津、通络明目之效。

DR 的发病机制与氧化应激、缺氧、炎症反应等密切相关。依据黄酮类化合物的多种生理活性，近年来大量研究[8]表明，黄酮类化合物对DR有显著的干预作用。本研究通过药物-化合物-靶点网络分析，发现了21个关键活性化合物。其中，槲皮素属于黄酮类化合物，具有强大的抗氧化、抗炎和抗糖尿病的功效[8]，通过抑制NF-κB 和促进半胱天冬酶-3（Caspase-3）活性发挥抗ARPE-19 细胞凋亡的作用，抑制ARPE-19细胞高糖诱发的损伤[9]。山奈酚属于黄酮醇类化合物，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性质等多种药理作用[10-11]，通过促进细胞外调节激酶（extracellular regulatory protein kinase，ERK）和血管生成抑制蛋白1（vasohibin-1，VASH1）信号传导保护视网膜神经节细胞免受高糖诱导的损伤[12]。水蛭素是一种特异性凝血酶抑制剂，在心脑血管疾病、外科深静脉血栓、肿瘤、关节炎、外伤性增生性玻璃体视网膜病等方面并取得了很好的疗效[13]，有相关研究表明，水蛭素通过抑制STAT3 信号通路，抑制人肾小管上皮细胞纤维化的作用[14]。异鼠李素属于黄芪总黄酮的成分之一，具有内皮保护作用、抗血小板凝集、抗氧化等多种药理作用[15]。PPI 网络表明芪明颗粒多靶点抗DR 的作用特点，网络中STAT3、JUN、SRC、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK14、CXCL8、EGFR、MAPK8、IL-1B、FOS 和EGF 等14 个靶点作用较强。IL-1B 和IL6 可引起白细胞聚集，炎症反应，与DR 的发展关系密切，其中IL6 通过上调VEGF 达促使新生血管形成并增加血管通透性[16]。MAPK1、MAPK8和MAPK14都是MAPK激酶家族的一员，主要参与细胞增殖、生长和分化等过程[17-19]，其中MAPK8 在细胞生存、细胞死亡、炎症及其他病理过程中也起着重要的调控作用。

为了进一步说明靶蛋白在基因功能和信号通路中的作用，本研究进行了GO 功能富集和KEGG通路富集分析。GO 功能富集结果显示，芪明颗粒治疗DR 与RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、血管生成的正调控、细胞对脂多糖的反应、炎症反应、免疫反应、内皮细胞凋亡过程的负调控和对缺氧的反应等生物过程相关。由KEGG通路富集分析可知，芪明颗粒治疗DR主要通路有TNF信号通路、HIF-1信号通路、癌症通路、VEGF 信号通路、PI3K/Akt 信号通路、MAPK 信号通路和NF-κB 信号通路等。DR 是视网膜长期处于缺血缺氧状态，继而诱导VEGF 表达上调，促进PDR患者视网膜新生血管的形成[20]，可激活下游PI3K/AKT 通路，可加速内皮细胞发生迁移、增殖，形成新生微血管腔，最终形成稳定的血管[21]。TNF-α是炎症反应中具有代表性的炎症因子，通过作用于血管内皮细胞上的受体，激活NF-κB信号，引起视网膜毛细血管细胞凋亡，血管通透性增加，破坏血-视网膜屏障，促进DR 的发生发展[22]。HIF-1α是细胞内重要的缺氧信号蛋白，在高血糖和缺血缺氧状态下，诱导HIF-1α的表达上调，其下游重要的靶基因VEGF 也随之上调[23]，进而调控血管增生。以上诸条通路涉及到炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等，基于此推测芪明颗粒中的活性成分主要通过调控上述多条通路来发挥治疗DR的作用。

通过分子对接验证和靶点蛋白互作网络图，本研究认为STAT3、JUN、SRC、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK14、CXCL8、EGFR、MAPK8 和IL-1B等为核心治疗靶点，可被多个有效化合物作用，并对多个靶点产生相互影响，表明芪明颗粒对DR 有直接或间接的治疗作用。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接的方法，芪明颗粒可通过“多靶点-多途径”治疗DR，为芪明颗粒进一步深入探讨提供了一定的科学依据，同时也为中医药临床和实验的研究提供了新方法和新思路。当然，本研究的结论仍存在局限性，只是通过挖掘数据对芪明颗粒治疗DR 的药效机制进行预测，尚需要基础和临床药理试验进一步验证。